水泡口炎病毒抗肿瘤研究进展

　　作者：赵菊梅，李 秋，魏于全，文艳君　 作者单位：1.716000 陕西延安大学医学院药理教研室;2.四川大学华西医院肿瘤中心生物治疗国家重点实验室

　　【关键词】 水泡口炎病毒;肿瘤;治疗

　　1 水泡口炎病毒的结构和生物学特征

　　1.1 水泡口炎的结构

　　水泡口炎病毒是弹状病毒科的原型病毒，负链RNA病毒，为水泡病毒属。弹状病毒呈子弹状结构，宽约45～100 nm，长约100～400 nm。基因组为线状不分节段的单股负链RNA , 全长11.6 kb ,从3′到5′端依次排列着N、P、M、G、L 5个不重叠的基因。在N基因3′端有非翻译的先导序列,在NP、PM、MG、G L基因之间存在着间隔序列,在5′端有59个核苷酸的非翻译区[4]。在病毒的转录过程中，有L和P蛋白以及宿主因子复合物形成的聚合酶结合于约11kb的基因组RNA的末端，转录成一条47个核苷酸的先导RNA和编码N、P、C、M、G、L蛋白的信使RNA的5聚体。

　　1.2 生物学特性

　　水泡口炎病毒(VSV)主要感染家畜和马，有时也会引起猪和羊的感染，在加勒比海被认为是地方流行病，偶尔也发生在美国。从白蛉和蚊科动物体内可以提取到VSV病毒，表明水泡口炎病毒可以通过蚊虫传染[12]，病毒感染后引起口周水泡形成。一般情况下VSV不引起人类的感染，偶尔感染症状比较轻微，表现出类感冒症状，伴有轻度的发烧。

　　2 VSV肿瘤治疗研究现状

　　研究者已经表明VSV可以感染多种肿瘤细胞[34]，更重要的是，VSV的溶瘤作用不受细胞遗传因素的限制，比如：VSV可以裂解有Myc或p53基因突变的细胞，也可以裂解存在Ras活化的细胞或者Bcl2过表达细胞[5]。因此，VSV作为一种溶瘤病毒已经受到广泛的关注。不少的研究小组已经在裸鼠肿瘤模型及免疫完全的小鼠模型实验中证明了VSV病毒的溶瘤作用，如在乳腺癌、肝癌模型中VSV已经显示出明显的抗肿瘤效应[67]，这些结果对于进一步评价和发展VSV的溶瘤治疗作用是十分有意义的。另外VSV的溶瘤机制除了病毒快速复制引起细胞裂解作用外，可能还与其诱导细胞凋亡有关，其诱导凋亡机制可能与内源性的caspase9途径有关[8]，但是其确切的机制目前还不是很清楚。近几年来对VSV的研究主要在于改善VSV的溶瘤能力以及肿瘤特异性等方面，使改造后病毒能够更安全的用于肿瘤治疗。比如，构建VSV病毒突变体，可以将具有抑制宿主抗病毒反应的M基因突变等。

　　VSV作为一种溶瘤病毒最主要的优势在于其遗传上的适应性以及可以插入较大外源基因。通过基因工程对VSV进行改造，将一些免疫调节因子或者自杀基因插入基因组DNA，从而使VSV在肿瘤治疗中的应用有了更为广阔的前景。还可以通过用一些新的蛋白取代病毒表面蛋白如G蛋白，从而得到具有肿瘤靶向性的重组VSV病毒。现在已经产生了携带有自杀基因TK、免疫调节因子IL4或者IFNβ的VSV病毒[911]。这些重组病毒仍具有抗黑色素瘤及腺癌的作用，而且可以有效地阻止肿瘤的转移，同时诱发了较野生型VSV病毒更强的T细胞免疫反应。通过对新的VSV溶瘤病毒溶瘤机制的研究，新的病毒制剂将会在其有效性、特异性及安全性方面得到进一步的改善[12]。由于转化细胞中干扰素信号途径缺陷,表达IFN的VSV病毒可以快速地在肿瘤细胞中扩增并引起细胞裂解，而且由于IFNβ分泌作用将产生对细胞的保护作用，从而不会引起正常细胞的裂解。这种VSVIFNβ病毒重组体还可以刺激机体的抗肿瘤免疫反应和主动免疫。因此，新的VSV病毒产物将更有效的靶向到肿瘤细胞和肿瘤组织并裂解肿瘤细胞，同时产生有效的抗肿瘤免疫反应。

　　VSV已经在胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝细胞肝癌、乳腺癌以及前列腺癌均显示出抗癌作用，基因工程VSV病毒增强了抗肿瘤特异性、安全性和有效性。

　　2.1 VSV在肿瘤细胞选择性复制

　　VSV一般不引起人类的感染，血清检测很少有阳性者。VSV在高剂量感染时会引起神经系统的损害，但在低剂量时由于激活机体的天然免疫和主动免疫机制将病毒清除，而不会引起损害[13]。在动物模型研究中可以观察到，首次感染该病毒一周后就会引起体液免疫,产生强的抗N蛋白和G蛋白抗体反应，并可以引起细胞毒性T细胞反应[14]。然而，产生的抗G蛋白抗体与病毒表面G蛋白结合产生了明显中和病毒的作用，使病毒失去了感染能力。数据研究表明：B细胞缺陷的小鼠对VSV非常敏感，感染后9天就会因脑膜炎而死亡。T细胞缺陷的小鼠也会在感染后30天死于神经系统病变 [15]。在转化的细胞中可能存在着抑制病毒感染的天然免疫系统的缺陷，因此，在肿瘤细胞中，病毒就可以避免抗病毒反应对它的抑制作用而得到大量复制。这些表明VSV可能成为肿瘤细胞的裂解剂用于肿瘤的治疗[16]。多年的研究也表明，干扰素系统在抑制多种病毒(包括VSV)过渡复制中起着非常重要的作用。干扰素属于细胞因子家族成员，大约含有150个氨基酸，可以与特异性细胞表面受体结合，激发抗病毒免疫反应基因表达的上调[1719]。干扰素具有两种类型：即Ⅰ型和Ⅱ型。前者又分为IFNα、IFNβ、IFNω;后者仅有一类，即IFNγ。IFNα和IFNβ基因串联在一起，定位于人第9对染色体的短臂。成纤维细胞、树突状细胞等多种细胞可以分泌IFNβ。Ⅱ型干扰素定位于人第12对染色体长臂，主要由Th1淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞所分泌。Ⅰ型干扰素可以通过多种刺激产生，如细菌、病毒、双链RNA、生长因子以及细胞因子。然而有关病原体感染细胞后的早期识别、激发机体天然免疫及主动免疫反应的分子机制研究才刚刚开始，目前的研究表明Toll样受体(TLR)途径参与了这一过程，每一种Toll样受体识别相关的微生物抗原，也称为病原相关分子模式(PAMPS)，例如:TLR2可识别革兰氏阳性菌共有的肽聚糖，TLR9识别原核细胞基因组中未甲基化的CPG DNA序列和DNA病毒，TLR3特异性地识别双链RNA，而TLR7、8特异性的识别单链RNA病毒[2022]。受体分子中存在Toll结合区如MyD88，它是35kb的胞浆内蛋白质，是TLR/IL1超家族信号转导途径中普遍存在的信号转导分子，也是TLR/IL1超家族的重要成员之一。从而将信号传递给白介素受体相关激酶(interleukin receptorassociated kinases)使得TankBinding激酶1、NFκB和JNK途径激活，引起了早期免疫反应基因IFNβ转录，IFNβ具有自分泌和旁分泌功能，作为一个配体和特异性的受体结合使得Jak/STAT途径被激活，同时诱导了多种基因在启动区表达，包括干扰素刺激反应元件。关键的IFN诱导基因是IRF7，它是IFNα转录激活所必需的，且需要磷酸化，因此，早期免疫反应信号途径的不断刺激以确保TBK1的磷酸化以及IRF3和7激活[2324]。另外一类关键的干扰素诱导基因包括主要组织相容性抗原，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和双链DNA依赖的蛋白激酶(PKR)。另外，IFN还可以激活NK细胞、促进DC细胞的成熟，这些对主动免疫反应的产生是相当重要的。因此，天然免疫反应诱导了这些基因的表达，从而抑制了病毒的复制，刺激了TCRMHC肽的加工处理，诱导了APCs表面共刺激分子的表达，从而产生了病原体抗原特异性T细胞[25]。细胞内天然免疫识别途径已经有所报道，但是除了TLR途径外还有胞外PAMPs途径的探讨也是相当重要的。病毒感染细胞后开始在细胞内复制，同时激活了应激反应途径。核内病毒RNA识别途径包括两种相关的分子-维甲酸诱导基因1(RIGI)和黑色素瘤分化抗原5，两者氨基酸残基末端均含有CARD(caspaserecruitment domain)like 结构域和RNA解旋酶模序DExD/H[2627]，这些分子对于Ⅰ型干扰素激活及其功能是有效的。与TLR受体通过刺激NFKB及TBK途径一样，目前的中间激活途径还不清楚。但是死亡受体分子-受体相关蛋白1(RIP1)和FAS相关死亡受体结构域(FADD)是细胞内诱导IFN非常重要的分子，很可能在激活RIGⅠ样分子中起着关键性的作用。VSV细胞对FADD或RIP缺失的细胞敏感，而且感染后快速复制并裂解细胞[2324]。VSV病毒可以在多种肿瘤细胞中快速复制，推测可能存在着这种内源性天然免疫识别途径的缺失，因而给病毒的快速复制和扩散提供了有利的条件。这种细胞内免疫识别途径虽然还需得到进一步的解释，但是已经能够表明这在细胞的抗病毒防御反应中起到了非常重要的作用。

　　目前的研究表明VSV可以在多种组织培养细胞中复制，而且多数属于转化细胞或恶性肿瘤细胞,可以推测上述天然免疫识别途径在VSV敏感细胞中缺失。因此干扰素诱导基因的诱导缺失或者干扰素基因自身的缺失在这些VSV敏感细胞中是普遍存在的，而且以前的报道也表明了在肿瘤形成过程中IFN途径受损，如人的恶性淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、恶性胶质瘤以及永生化的鼠成纤维细胞IFN基因存在着染色体定位异常[2829]。然而在发现这些部位存在肿瘤抑制基因之前，干扰素是否具有直接的抑癌作用还是一个有待解决的问题，这一发现表明可能干扰素基因的缺失引起了细胞转化过程受损。然而，干扰素基因本身不是原发肿瘤抑制基因，干扰素诱导途径和(或)多数的干扰素诱导基因包括干扰素调节因子(IRF)基因家族、TRAIF和前髓细胞性白血病基因(PML)都是重要的肿瘤抑制基因，参与细胞生长调节，同时保持着有效的抗病毒免疫反应[3031]。 最后，有大量的证据表明：在一些恶性肿瘤细胞中JAK/STAT途径是失活的。

　　因此目前的发现表明IFN途径在多数的转化细胞中缺失，这种信号级联反应对于细胞的生长调节起着十分重要的，然而在肿瘤细胞中却失活。给病毒在肿瘤细胞中复制提供了有利的条件，最近的研究表明，VSV在肿瘤细胞中选择性复制与RAS/Raf1/MEK/ERK信号通路激活有着重要的关系[32]，也给VSV介导的细胞裂解提供了有力的证据。

　　2.2 VSV诱导凋亡相关研究

　　VSV作为溶瘤病毒的研究已经取得了明显的进展，被认为是一种很有前途的溶瘤治疗试剂。由于病毒感染正常细胞后会诱发干扰素的产生，产生抗病毒反应，因而不感染正常细胞。所以VSV可以选择性地在多种肿瘤细胞中复制，对于肿瘤治疗具有一定的靶向性。对于作用机制的研究目前尚不是很清楚，但研究表明，VSV 诱导了肿瘤细胞的凋亡，可能与其抗肿瘤作用有关。VSV引起细胞凋亡的报道已经有几十年的历史，但是讫今为止对其诱导凋亡的机制尚不是很清楚。在下面的综述中将主要阐述VSV感染后引起细胞凋亡的一些研究进展，讨论其病毒成分在诱导凋亡中的作用，以及在今后的研究中如何将这一作用更好的用于肿瘤治疗。

　　早在1995就有关于VSV诱导凋亡的相关报道，Koyama 等首次通过DNA片段分析以及细胞学观察表明VSV感染HeLa细胞后引起的细胞病变与其诱导的凋亡途径有着密切的关系。细胞感染病毒后5小时细胞染色体DNA开始断裂，8小时后出现染色体聚集，细胞的这些变化与细胞变圆是相关的，同时培养基分析结果显示典型的病毒感染[3233]。后来的许多研究也证明了VSV 诱导凋亡这一假设。比如：Razvi用VSV 感染L929 或者NIH3T3细胞后引起了染色体DNA断裂[3334]，VSV 感染人T淋巴细胞 Jurkat 后也诱导了细胞的凋亡，在病毒感染Jurkat 细胞4～5小时，可以检测到DNA 断裂和多聚腺苷酸切割酶等凋亡标记物，而且caspase3和 caspase7的活性与VSV 的感染密切相关。另外，用凋亡抑制子ZDEVDfmk或者bcl2过表达就会抑制VSV感染引起的Jurkat 细胞凋亡[35]。

　　最近关于VSV 病毒在中枢神经系统持续存在机制研究表明：病毒感染人中枢神经细胞系H4可以引起凋亡性死亡，这一结论也通过TUNEL染色及DNA ladder 所证实[36]，并且用广谱的caspase抑制剂ZVADfmk可以阻断VSV感染引起的细胞凋亡，使H4细胞转染bcl2和bclxL，使其在细胞中高表达，再用VSV 感染，结果延长了H4细胞的生存时间[37]。这些研究都表明，VSV诱导的细胞病变并不局限于某一种细胞模型，而且，病毒感染过程中诱导的凋亡可以通过细胞凋亡过程中的多种细胞核标记物所证实。

　　我们实验室进行了VSV联合吉西他滨在肺癌治疗中的研究[38]，通过体外培养人肺腺癌A549细胞、小鼠Lewis肺癌LLC细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，分别给予VSV或吉西他滨(gemcitabine，GEM)单独处理、联合处理或不经处理。在倒置显微镜下观察，联合处理组肿瘤细胞出现明显的细胞病变。MTT实验定量分析VSV和GEM联合处理导致明显增强的肿瘤细胞杀伤作用，联合指数分析提示联合处理产生协同或相加效应。DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测发现VSV和GEM联合处理能增强诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡。测定VSV和GEM联合处理肿瘤细胞中VSV的滴度，我们发现GEM不影响VSV在体外培养细胞中的复制。我们又建立了人A549肺腺癌BALB/c裸鼠肿瘤模型和Lewis肺癌C57BL/6小鼠肿瘤模型，分别予以VSV或GEM单药治疗、联合治疗或不治疗。VSV和GEM联合治疗导致更强的抗肿瘤效应，肿瘤完全消退，小鼠生存期明显延长，没有明显的不良反应。同样，GEM不影响VSV在肿瘤组织中的复制。联合治疗组小鼠的残存肿瘤中，凋亡细胞明显增多，而且细胞凋亡水平与抗肿瘤效应呈现典型的正相关。

　　我们的实验结果首次表明VSV和GEM联合治疗能增强诱导肿瘤细胞凋亡，产生更强的抗肿瘤效应，为肺癌的生物—化疗提供了新的途径。

　　3 展望

　　研究表明，VSV 感染引起的细胞凋亡主要是激活了caspase3，而caspase3的激活并不影响病毒在细胞中的复制，让细胞高表达bcl2来抑制caspase3的激活所获得的病毒滴度与未处理的细胞没有差别[38]。因此，目前的研究并没有清楚地表明在VSV病毒感染期间诱导的细胞凋亡是否有利于病毒的持续感染，也有研究报道VSV诱导的细胞凋亡过程并不影响病毒在细胞内的复制过程，所以将来的研究有待于解决这一问题。

　　目前，对于VSV感染引起的细胞凋亡机制的研究报道很少。迄今为止，只有Desforges等人的研究报道，用广谱的caspase抑制剂可以有效的抑制VSV诱导的细胞凋亡途经的激活，但是特异性的caspase8或caspase9抑制剂则不能完全抑制细胞凋亡的发生[39]。那么，将来的实验研究对于VSV引起细胞凋亡途径的研究也将是必要的和有意义的，同时对于VSV的化疗增敏作用的研究也是很有意义的。

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