白藜芦醇对内皮细胞CD40途径的影响

　　作者：沈阳辉1,2 ，朱鹏立1，贾德安1， 阮景明1 ，余惠珍1 作者单位：1.福建省立医院，福建省临床老年病研究所，福建医科大学省立临床医学院，福建 福州 350001;2.福建省立医院内科ICU

　　【摘要】 目的：观察白藜芦醇对内皮细胞CD40途径活化后CD40和E-选择素表达的影响。方法：白藜芦醇(10μmol/L)预孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后，以可溶性CD40配体(sCD40L，10μg/ml)刺激，流式细胞术检测内皮细胞E-选择素和CD40分子的表达，半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测E-选择素和CD40基因的转录。结果：sCD40L诱导内皮细胞E-选择素和CD40基因的显著转录和表达(P均<0.01)，白藜芦醇显著抑制E-选择素和CD40基因的转录和表达(P<0.05～<0.01)。结论：结果提示白藜芦醇可能通过抑制CD40途径发挥抗动脉粥样硬化作用。

　　【关键词】 白藜芦醇,内皮细胞,动脉硬化;E选择素;抗原，CD40

　　Abstract：Objective:To observe the effect of resveratrol on expression of E-selectin and CD40 after activation of CD40 pathway on endothelial cells.Methods:Stimulate human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with soluble CD40 ligand (sCD40L) after preincubation of resveratrol.Detect the expression of E-selectin and CD40 on the surface of HUVEC with flow cytometric analysis and the transcription level of E-selectin and CD40 gene with semiquantitative RT-PCR.Results:sCD40L (10μg/ml) significantly induce the transcription and expression of E-selectin and CD40 on HUVEC(P<0.01 all), which were significantly inhibited by resveratrol (10μmol/L,P<0.05～<0.01).Conclusion:The results indicate that inhibition of CD40 pathway may be one of the mechanisms for resveratrol to play its antiatherosclerosis effect.

　　Author′s　address：Fujian Provincial Hospital, Fujian Institute of Clinical Geriatrics, Fujian Medical University, Fuzhou,Fujian,350001, China

　　Key words：Resveratrol;Endothelial cells;Atherosclerosis;

　　E-selectin;Antigens,CD40 流行病学调查显示[1]：动脉粥样硬化的低发病率和适量饮用红葡萄酒之间存在明显的相关性。红葡萄酒的这种心血管保护作用，即“法国悖论”，可以从其中的多酚类物质，特别是白藜芦醇(resveratrol，Res)中得到答案[2]。已经证实，Res可以通过多种途径发挥对心血管系统的保护作用。

　　研究表明，CD40-CD40L途径在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)炎症调节中的作用日益明确，并贯穿在AS发生发展乃至斑块破裂的全过程[3，4]。近年研究发现CD40与CD40L结合可诱导内皮细胞表达产生血管粘附分子-1、E-选择素等，从而在AS的发生与发展中发挥作用。CD40-CD40L广泛存在于AS斑块的各种细胞(如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等)，其相互作用显著影响AS相关细胞的功能，并且与斑块的稳定性密切相关;阻断这一系统的相互作用可以防止AS的发生与发展[5～7]。

　　Res可调节多个炎症基因的表达，是否也调节CD40的表达国内、外尚未见到相关报道。本研究通过体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)探讨Res在CD40信号途径中的作用，为Res的抗AS作用增加新的理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　原代HUVEC及培养基M200(美国Cascade Bio公司);反式Res、二甲基亚砜(美国 Sigma公司);sCD40L(英国Peprotech公司);鼠抗人E-选择素单克隆抗体(FITC标记，奥地利Bender公司);鼠抗人CD40单克隆抗体(PE标记，苏州基因公司);Trizol 试剂(美国Invitrogen公司);两步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒(美国Promega公司)。引物为宝生物工程(大连)有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及干预：将原代HUVEC和含有低血清生长添加物(LSGS)的培养基M200置于37℃、5 % CO2 的培养箱中培养，取第3～5 代细胞用于实验。将HUVEC以5×104/ml的密度接种于六孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，细胞生长融合至80%时进行实验。实验前24h换用无血清M200培养基使细胞同步化，然后进行药物干预。将HUVEC随机分为3组，分别为对照组、可溶性CD40配体(sCD40L)组和Res+ sCD40L组，每组设2个复孔。药物处理组实验顺序为：Res(10μmol/L)预孵育2h后加入sCD40L(10μg/ml)，处理细胞4h后取细胞检测E-选择素表达，24h后取细胞检测CD40表达。实验重复5次。

　　1.2.2 流式细胞术：对于上述条件干预后的细胞，弃上清液后以0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)溶液消化，500g离心2min收集细胞，以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次后，吹打混匀，制成1ml单细胞悬液。取50μl细胞悬液，加入10μl抗人E-选择素单克隆抗体或抗人CD40单克隆抗体，室温避光孵育30 min。以PBS溶液洗涤细胞以除去未结合抗体，500g离心2min收集细胞，再加入1ml PBS吹打混匀，用流式细胞仪检测。

　　1.2.3 半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：收集上述处理过的HUVEC，利用RNA提取试剂TRIzol提取各组细胞总的RNA，并用核酸分析仪测各组RNA浓度，光密度(OD)260/280均为1.8～2.0，提示RNA纯度较高。取1μg RNA模板在20μl反应体系中逆转录mRNA为cDNA。取2μl逆转录产物，以Ex Taq DNA聚合酶在25μl反应体系中进行PCR。E-选择素基因引物：上游5′-TGT GAA GCT CCC ACT GAG T-3′，下游 5′-TCT GGC ATA GTA GGC AAG AA-3′，目的片段307bp;PCR反应条件优化为：退火温度50℃，循环数36。CD40基因引物：上游5′-TGC CAG CCA GGA CAG AAA CT-3′，下游 5′-GGG ACC ACA GAC AAC ATC AG-3′，目的片断424bp;PCR反应条件优化为：退火温度57℃，循环数27。以磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)为内参照：上游5′-CAC CAT CTT CCA GGA GCG AG-3′,下游5′-TCA CGC CAC AGT TTC CCG GA-3′, 目的片断238bp;PCR反应条件优化为：退火温度55℃，循环数24。反应完毕，取反应产物10μl于1.5%的琼脂糖凝胶中100V电泳20min，凝胶成像系统下进行扫描，图像分析系统检测各组目的基因及其GAPDH基因的灰度值，计算两者的比值作为目的基因的相对表达量。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS13.0软件包进行统计分析，各指标均以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 流式细胞术检测E-选择素分子和CD40分子表达情况

　　2.1.1 Res对 HUVEC表达E-选择素分子的影响：流式细胞检测结果显示sCD40L刺激后，HUVEC表达E-选择素分子的阳性细胞百分比和平均荧光强度较对照组显著增加(P均<0.01)。Res预孵育的HUVEC，其E-选择素表达的阳性细胞百分比(P<0.01)和平均荧光强度(P<0.05)较sCD40L刺激组明显降低(表1)。表1 流式检测E-选择素分子的表达注：sCD40L：可溶性CD40配体，Res：白藜芦醇。与sCD40L组相比△P<0.05，△△P<0.01。下表同。

　　2.1.2 Res对HUVEC表达CD40分子的影响：流式细胞检测结果显示sCD40L刺激后，HUVEC表达CD40分子的阳性细胞百分比和平均荧光强度较对照组显著增加(P<0.01)。较之sCD40L组，Res预孵育的HUVEC，其CD40表达的阳性细胞百分比明显减少(P<0.01)，平均荧光强度明显降低(P<0.05)(表2)。表2 CD40分子表达流式检测结果

　　2.2 RT-PCR检测E-选择素基因和CD40基因转录情况

　　2.2.1 Res对内皮细胞E-选择素 mRNA转录的影响：HUVEC经sCD40L刺激4h后，E-选择素基因转录水平较对照组显著升高(P<0.01),经10μmol/L Res预孵育后E-选择素基因的转录水平较sCD40L刺激组显著降低(P<0.01)(图1，表3)。

　　2.2.2 Res对内皮细胞CD40 mRNA转录的影响：HUVEC经sCD40L刺激24h后，CD40基因转录水平较对照组升高(P<0.05)，经10μmol/L Res预孵育后CD40基因的转录水平较sCD40L刺激组降低(P<0.05)(图2，表3)。表3 E-选择素基因和CD40基因PCR产物比灰度值比较

　　3 讨 论

　　越来越多的证据表明，炎症及免疫反应在AS和急性心血管事件的发生中发挥重要作用。

　　CD40-CD40L是一对互补跨膜糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用。1997年Mach等发现在人类动脉粥样斑块内CD40-CD40L可同时表达，而在正常动脉壁内没有这一分子对的表达[8]。CD40途径的活化可以增加趋化因子、细胞因子[9]、基质金属蛋白酶(MMPs)[10]及促凝物质的表达，这些因素贯穿于AS的整个过程并与斑块的不稳定和急性冠脉综合征的发生有关。动物实验证实阻断CD40-CD40L的相互作用可抑制AS病变早期斑块的形成和炎症[5～7]。这表明CD40途径不仅作为AS的始动因素，还是AS发展的重要介质，进一步支持了在AS及其并发症中这一特殊炎症信号途径的作用。因此，阻断CD40途径成为预防AS斑块不稳定与破裂的特殊手段。

　　E-选择素是属于选择素家族的一种细胞粘附分子，只在激活的内皮细胞表达，能够介导炎症早期白细胞向损伤内皮细胞的滚动和粘附，在AS斑块的形成中起到关键作用。CD40主要表达在B细胞、内皮细胞、活化的单核/巨噬细胞上，炎症因子可诱导其表达，其基因转录的增加也可能是通过核转录因子NF-κB和信号转导子与转录激活子途径(signal transducer and activator of transcription，STAT)信号途径实现的。CD40可以和T细胞、单核/巨噬细胞、血小板表面的CD40L结合，其胞内的结构变化可调节肿瘤坏死因子受体相关因子的稳定性，进而调节NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)等信号转导途径的活化，导致了炎症基因的转录和表达。

　　内皮细胞CD40途径的活化可增加活性氧簇(reactiveoxygen species，ROS)的产生，使得单核细胞趋化蛋白1、E-选择素、血管细胞黏附分子-1和细胞间黏附分子-1等表达增加[11]，这种作用可几乎完全被抗CD40L的单克隆抗体所阻断。Holmes等的研究表明，Res可有力地抑制NF-κB的核转位及其抑制因子α的降解，从而强烈抑制NF-κB的活化和NF-κB依赖基因的表达[12]。

　　在本实验中Res预孵育的HUVEC，其E-选择素和CD40表达的阳性细胞百分比和平均荧光强度均较sCD40L刺激组明显降低，表明Res可抑制sCD40L活化的HUVEC表达E-选择素分子及CD40分子。同时，利用重组sCD40L作为刺激因素，特异性地与CD40分子结合，活化HUVEC的CD40途径，进一步检测其所介导的炎症基因CD40、E-选择素的表达。结果发现Res可以显著抑制CD40途径活化所介导的CD40、E-选择素的表达，显示了Res强大的抗炎作用。

　　本实验首次报道了Res可以抑制CD40途径的活化以及CD40基因的表达，由此推测Res可能通过抑制CD40-CD40L活化后炎症信号途径，减轻或延缓AS的发生和发展，从而为Res的抗AS作用机制提供了新的理论依据。至于其确切的作用环节，尚有待进一步深入的研究来揭示。

　　【参考文献】

　　[1]Mukamal KJ, Conigrave KM, Mittleman MA, et al. Roles of drinking pattern and type of alcohol consumed in coronary heart disease in men[J]. N Engl J Med, 2003, 348 (2):109-118.

　　[2] Sato M, Maulik N, Das DK. Cardioprotection with alcohol: role of both alcohol and polyphenolic antioxidants[J]. Ann NY Acad Sci, 2002, 957:122-135.

　　[3] Andre P, Nannizzi-Alaimo L, Prasad SK, et al. Plateletderived CD40L: the switchhitting player of cardiovascular disease[J]. Circulation, 2002, 106(8):896-899.

　　[4] Cipollone F, Ferri C, Desideri G, et al. Preprocedural level of soluble CD40L is predictive of enhanced inflammatory response and restenosis after coronary angioplasty[J]. Circulation, 2003, 108(22):2776-2782.

　　[5] Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, et al. Reduction of atherosclerosis in mice by inhibition of CD40 signalling[J]. Nature, 1998, 394(6689):200-203.

　　[6] Schonbeck U, Sukhova GK, Shimizu K, et al. Inhibition of CD40 signaling limits evolution of established atherosclerosis in mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(13):7458-7463.

　　[7] Lutgens E, Cleutjens KB, Heeneman S, et al. Both early and delayed anti-CD40L antibody treatment induces a stable plaque phenotype[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(13):7464-7469.

　　[8] Mach F, Schonbeck U, Sukhova GK, et al. Functional CD40 ligand is expressed on human vascular endothelial cells, smooth muscle cells, and macrophages: implications for CD40-CD40 ligand signaling in atherosclerosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(5):1931-1936.

　　[9] Schonbeck U, Libby P. The CD40/CD154 receptor/ligand dyad[J]. Cell Mol Life Sci, 2001, 58(1):4-43.

　　[10] Schonbeck U, Mach F, Sukhova GK, et al. Regulation of matrix metalloproteinase expression in human vascular smooth muscle cells by T lymphocytes: a role for CD40 signaling in plaque rupture? [J].Circ Res, 1997, 81(3):448-454.

　　[11] Henn V, Slupsky JR, Grafe M, et al. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells[J]. Nature, 1998, 391(6667):591-594.

　　[12] Holmes-McNary M, Baldwin AS. Chemopreventive properties of trans-resveratrol are associated with inhibition of activation of the IkappaB kinase[J]. Cancer Res, 2000, 60(13):3477-3483.