Ether à gogo 钾通道与肿瘤

　　作者：刘芬,马军丽,庄国庆,何 燕 作者单位：100069 北京,首都医科大学公共卫生与家庭医学学院流行病与卫生统计学系

　　【关键词】 ether à gogo;钾通道;肿瘤;标记物;靶分子

　　近年的研究发现，一些离子通道如钾、钙、氯、钠等通道与肿瘤相关，特别是钾通道与肿瘤的关系最为密切。钾通道是细胞膜上种类最多、最为复杂的一类离子通道，它存在于多种细胞中，是细胞膜电位的重要控制因素。

　　ether à gogo (EAG)钾通道是电压门控性钾通道中的一个家族，该家族中的一些成员，如Eag1和Erg通道，特别是Eag1通道，可特异地在一些原代肿瘤细胞和肿瘤细胞系中表达，并与细胞的恶性转化、肿瘤细胞的增殖和转移密切相关。但目前由于缺乏该通道的特异性阻断剂和大多数研究只是在细胞系中而没有在原代肿瘤细胞中开展等因素的限制，EAG钾通道在肿瘤发生、发展过程中的作用还不明确。深入开展该项研究将有助于阐明肿瘤的发病机制;同时，也为临床肿瘤的早期诊断和治疗提供新的策略。

　　1 ether à gogo钾通道

　　1.1 ether à gogo钾通道的结构特点

　　1969年Kaplan等[1]在研究果蝇变异时发现一种雄性果蝇在乙醚麻醉下，可表现出缓慢节律性的摆腿活动，并发现了与该变异相关的独立基因位点，命名为ether à gogo(eag)(本文中以eag, erg和elk等小写字母表示基因，EAG表示ether à gogo钾通道家族)。1983年Ganetzky等[2]对该变异体进行了研究，发现该变异体的运动性神经元具有一种高频率的自发性动作电位及神经递质释放增多，克隆结果显示该变异的基因序列与电压门控性钾通道相似，将eag在蛙卵中表达证实了该基因编码一种电压门控性钾通道[3]。

　　哺乳动物的同源性基因筛查发现了另外两个与eag密切相关的基因，即elk (eaglike gene)和erg(eagrelated gene)。因此，EAG通道家族包括3个亚基因家族，即Eag(包括Eag1和 Eag2，首个字母大写表示EAG钾通道的亚家族)，Elk(包括2个成员)和Erg(包括3个成员)[4]。人的eag1基因的染色体位于1q32.12 [5]，eag2基因位于14q24.3 [6] 。本文将主要对EAG钾通道家族中与肿瘤相关的Eag1和Erg通道与肿瘤之间的关系进行综述。

　　功能性的EAG钾通道由四聚体组成，每一个亚单位的基本结构除了六次跨膜和一个孔道区外，还有几个高度保守区，N端的大部分结构与PerArntSim区相似，该区与探测氧化还原反应有关，C端包括了一个保守的环化核苷酸结合区，该区可能与通道蛋白的穿梭有关[7]，以及一个钙调素结合位点、一个双向性的核靶向信号和一个通道亚单位间相互作用区域[8]。Eag1通道(可能也包括Eag2)在胞外的氨基酸残基上还携带有糖基化区，N406氨基酸残基的糖基化是该通道蛋白维持正常结构和功能的必要条件，去糖基化将引起通道电流幅度的急剧下降和减慢通道活化[9]。

　　从EAG通道家族结构的复杂程度来看，该通道不仅仅是一种受膜电位调控而介导钾离子跨膜流动的孔道，同时它也能感受细胞膜外环境的变化(如低氧、钙调素信号等)，从而使通道开放或抑制，以调节细胞的电生理环境并进而影响细胞的功能活动以及生长与增殖。

　　1.2 ether à gogo钾通道的分布

　　生理状态下，Eag1通道主要分布于脑内(丘脑除外)细胞群中，也可在成肌细胞融合前被一过性地探测到，Northern blot检测显示其在胎盘中也有少量表达，而在其他组织没有发现其表达[10]。但是最新一项研究显示，虽然用实时RTPCR方法在上述组织外的其他组织未探测到Eag1通道 mRNA的表达，但用免疫组化方法在一些活检组织中发现了该通道蛋白的少量表达，包括胃腺的主细胞、胰腺的acini细胞、男性生殖系统的生精细胞和女性生殖系统的子宫内膜和宫颈内膜，特别是一些分泌活跃的腺体，都呈现免疫组化阳性反应，提示上述组织中也有Eag1通道的存在[11]。由于Eag1通道在正常组织中呈限制性表达，而在肿瘤组织中呈异位表达，提示其可能是一种潜在的肿瘤标记物。另外，Eag2在脑和骨骼中比较丰富，在心、肺等组织中也有一定的表达[6]。而Erg通道分布较广泛，已经在心、脑、肾、肝、睾丸、子宫、前列腺等组织发现了该通道的转录因子[12]。

　　2 ether à gogo 钾通道与肿瘤的关系

　　2.1 ether à gogo 钾通道在肿瘤细胞中的表达

　　近年来，研究发现Erg通道在人子宫内膜癌[13]、 白血病[14]、 催乳素瘤[15]、神经胶质瘤[16]和结直肠癌[17]中有异常表达或功能活动。Cherubini等[13]在人子宫内膜癌细胞中探测到了Erg 通道，并指出该通道在增生的子宫内膜中无表达，因此作者认为Erg通道是一种鉴别子宫内膜癌与单纯性子宫内膜增生的潜在性工具。有关Erg通道与白血病关系的研究得出了Erg 通道在白血病细胞中总是开放的，而在相对应的正常细胞中却是关闭的结论，提示Erg通道的活动可作为造血组织肿瘤细胞新的分子标志[14]。

　　Eag1通道在原代肿瘤细胞中的过量表达或功能活动也有越来越多的报道。Farias等发现了Eag1通道在宫颈癌细胞中的表达并记录到了通道电流[18] ;Hemmerlein等[11]用免疫组化和实时PCR方法对来源于食管癌、肝癌、乳腺癌、支气管肺癌等多种常见肿瘤的组织进行了检测，在所有的样本中，几乎70%～80%的肿瘤组织都呈Eag1信号强阳性反应，检测结果见表1;另外一项研究显示，在原代软组织肉瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤[19] 以及结直肠癌[20] 中也发现了Eag1通道的表达。这就为EAG通道在肿瘤临床诊断和治疗中的应用提供了分子依据。

　　2.2 ether à gogo钾通道在细胞恶性转化中的可能作用

　　该方面的报道主要见于Pardo等[5]的研究。他们发现，将大鼠eag1基因转染到CHO细胞并使其过度表达时，CHO细胞表现出了生长快速、能在非常低的血清浓度下生长、接触抑制丧失等特性，而作为对照，过表达Kv1.4通道的CHO细胞未出现上述现象。提示过表达Eag1通道可诱导细胞恶性转化。同时他们进行了一项有趣的在体实验，给严重免疫缺陷的小鼠分别注射转染了人Eag1和Kv1.4基因的CHO细胞，发现携带Eag1通道的肿瘤较转表1 Eag1通道在不同肿瘤组织中的免疫组化监测结果 染了Kv1.4通道的肿瘤生长更迅速和更具侵袭性。

　　虽然Eag1通道自身具有致癌性和有利于肿瘤细胞生长，但是，该基因在肿瘤发生过程中的确切作用还不清楚。在生物体内是细胞的恶性转化引起了Eag1通道的异常表达还是Eag1通道的异常表达引发了肿瘤?EAG通道正常表达时为什么不引起肿瘤?正常表达时其功能是什么?在肿瘤细胞中eag1基因是如何打破基因沉默状态而异位表达的?这些均将有待于进一步探讨。

　　2.3 ether à gogo钾通道在肿瘤细胞增殖中的可能作用

　　最近Weber等[21]在HEK293细胞中对Eag1通道进行了研究，他们使用siRNA技术观察了干扰Eag1通道表达对体外肿瘤细胞系行为学的影响，结果表明，阻断Eag1通道在mRNA水平的表达后，可明显减少肿瘤细胞系的增殖，而没有引起任何可观察到的非特异性反应。其原因可能与在细胞周期G1期的早期，细胞膜去极化状态较低，在这种状态下Eag1通道能被活化 (而其他Kv通道则不能)，引起钾离子外流，使细胞内超极化，吸引Ca2+入胞或内质网释放Ca2+，最终引起G1期向S期的转换，使肿瘤细胞处于旺盛的生长状态有关[22]。在此期内，Eag1通道起到了控制该期的特异细胞周期检验点(specific check point)的作用[23]。因此，可以看出，调节EAG通道的表达及功能在肿瘤的临床治疗方面存在着巨大的潜力。

　　此外，通过已知的通道非特异性阻断剂西沙比利阻断人Erg通道，能够抑制胃粘膜肿瘤细胞的增殖，而且这种抑制作用是剂量依赖性的，并能导致细胞周期从G1期到S期的转变停滞[24]。

　　3 ether à gogo钾通道研究的临床应用

　　3.1 潜在的肿瘤早期诊断的标记物

　　如前所述，由于EAG通道在正常组织和肿瘤组织中的差异性表达，为该通道成为肿瘤细胞标记物提供了可能。根据Eag1通道的跨膜特点，将识别Eag1通道膜外部分的特异性抗原用红外激发发光染料如AlexaFluor 680或Cy5.5标记，用近红外线荧光成像技术，使得小分子的抗原在活体内变得可视。

　　Stuhmer等[25]的实验室应用这项技术，观察了人乳腺癌细胞在免疫缺陷小鼠体内的分布情况，发现荧光不仅出现在肿瘤部位，还出现在肿瘤周围的触诊没发现转移的淋巴结。在该研究中，Stuhmer等又对传统的抗体制备方法进行了改良, 改良后的抗体只含有Fab区的重组单链抗Eag1抗体，可以更容易的穿透致密的肿瘤组织，也更易于红外线荧光技术在Eag1通道肿瘤标记检测中的应用。

　　因此，应用这项方法不仅可观察到在体肿瘤生长和转移的情况，为临床早期诊断和治疗提供线索，同时也能通过观察药物是否引起肿瘤消退而研究一些新药的疗效。

　　3.2 肿瘤转移和预后的指标

　　研究表明，Erg 通道在人的原位结直肠癌中表达较高，在转移的结直肠癌中表达最高，而在正常的结直肠粘膜及腺瘤细胞中无表达[17]。同样另一项研究也显示，在人胶质瘤细胞中，Erg 和Eag1通道的差异表达依赖于肿瘤细胞的恶性程度和细胞性质，而且这种表达可依据于肿瘤的恶性程度进行可逆的变化[16]。提示Eag1或Erg通道的表达可能作为影响某些肿瘤转移或预后的因子。

　　3.3 潜在的抗肿瘤药物作用的靶分子

　　Eag1通道不仅是一种高度特异的肿瘤标记物，同时还是一种跨膜蛋白，作为药物作用的靶分子，它较细胞内的肿瘤标记物更有优势，特别是该通道还具有诱导细胞转化、促进细胞增殖和转移等作用，因此，它将是一种理想的、潜在的抗肿瘤药物作用的靶分子。但是，目前这方面的研究正在起步。GomezVarela等[26]最近的一项研究报道，他们制备了一种能够特异的识别Eag1通道E3区的功能性抗体mAb56，该抗体不仅具备识别功能，还可抑制表达于HEK293细胞和神经母细胞瘤细胞系的Eag1通道电流幅度的40%以上。同时，他们检测了mAb56的抗肿瘤增殖能力，发现纳摩尔级的mAb56可阻断乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌细胞系细胞增殖幅度的20%～60%。在体实验表明，mAb56具有抑制人乳腺癌(MDAMB435)细胞在严重免疫缺陷小鼠体内生长的作用，其效果等同于标准对照药物环磷酰胺，且没有神经系统失常及体重减轻等副作用。在移植人胰腺细胞癌(PAXF1657)的裸鼠也可观察到这种抑制效果。

　　Pardo等[27]的这项开创性工作，为以Eag1通道为靶分子开展肿瘤治疗奠定了基础。他们设想通过以下方法抑制肿瘤细胞的生长和增殖：(1)应用Eag1通道的特异性抗体与通道结合，激活宿主的免疫活性，靶向性地攻击肿瘤细胞;(2)将通道的特异性抗体与细胞毒性或放射活性物质相耦联，靶向性的集聚在肿瘤细胞附近，摧毁肿瘤细胞或引起细胞膜上Eag1通道蛋白内化，去除有利于肿瘤细胞增殖的条件。此外，有可能通过抗体与通道的特异部位(如通道活化内传导路或孔道区等)相结合，即通过蛋白质蛋白质之间的相互作用，引起通道分子构象的变化，降低通道的活性或改变及修饰通道的门控性质，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

　　4 结论

　　通道的表达和功能的研究揭示了EAG通道与肿瘤之间的密切联系，EAG通道作为肿瘤标记物和药物作用的靶分子的研究也取得一些进展。但是，EAG通道与肿瘤关系的研究目前还存在很多限制性因素，如在原代癌细胞中开展研究有较多困难，很多研究是在肿瘤细胞系中开展，因此，难以判定EAG通道与肿瘤发生和发展的确切关系;Eag1通道还缺乏特异性阻断剂，虽然特异性抗体可部分代替其作用，但其抗体分子较大，在研究通道的生物物理学特性时，受到一定的限制。很好地解决这些问题将有助于阐明EAG 通道在肿瘤发生和发展中的确切作用，并为临床制定新的肿瘤诊断和治疗策略提供线索。

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