齐墩果酸对顺铂耐药胃癌SGC7901细胞增殖及细胞凋亡的影响

　　作者：李鸿梅 王敬春 齐占朋 周 丽 兴桂华 刘吉成 作者单位：(齐齐哈尔医学院中心实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

　　【摘要】 目的 探讨齐墩果酸(OA)对顺铂耐药胃癌 SGC7901(SGC7901/CDDP)细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法 体外诱导建立人胃癌顺铂耐药细胞株 SGC7901 /CDDP，MTT 比色法检测OA对 SGC7901/CDDP 细胞增殖的抑制作用;琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的降解;蛋白质免疫印迹检测凋亡相关蛋白酶的激活。结果 MTT实验证明OA对SGC7901/CDDP 细胞的生长有抑制作用，100 μmol/L OA作用72 h对SGC7901/CDDP细胞的抑制率达62%，并表现为时间和剂量依赖性;琼脂糖凝胶电泳实验证明100 μmol/L的OA处理SGC7901/CDDP细胞48 h后基因组DNA被降解，可见较典型的DNA梯形带;蛋白质免疫印迹分析表明，100 μmol/L的OA处理SGC7901/CDDP细胞48 h后，细胞内凋亡相关的蛋白酶caspase3被激活。结论 OA在体外能够诱导SGC7901/CDDP细胞凋亡，诱导凋亡的途径可能是线粒体途径。

　　【关键词】 齐墩果酸;SGC7901/CDDP;细胞增殖;细胞凋亡

　　胃癌目前手术治疗大部分是在进展期进行，而且单纯手术疗效甚差。作为综合治疗重要组成部分的化疗，已成为治疗胃癌的重要手段，较为有效的药物有5氟尿嘧啶、顺铂(CDDP)、阿霉素〔1〕等。凋亡通路的缺陷被认为是恶性肿瘤细胞异常增生和对化疗药物抵抗的主要原因〔2〕，因此诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一个有效途径。齐墩果酸 (Oleanolic Acid,OA) 是一种天然药物，广泛存在于植物中，以游离或结合成苷的形式存在。近年来发现OA可以通过多种机制抑制结肠癌细胞和肺癌细胞增殖〔3～5〕。本研究通过药物持续接触细胞培养的方法，逐步递增CDDP的浓度，体外诱导建立了人胃癌CDDP耐药细胞株SGC7901/CDDP，并进一步探讨OA对SGC7901/CDDP细胞增殖的抑制作用及作用机制,为胃癌的非手术治疗和天然药物的开发提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 SGC7901细胞株(中国科学院上海细胞库);CDDP(冻干型，山东齐鲁制药厂);OA购自中国药品生物制品检验检定所。OA用二甲亚砜(DMSO)溶解配制成80 mmol/L 的原液，-20℃ 储存;用含10%小牛血清RPMI1640培养基稀释成不同浓度的工作液。羊抗人的半胱氨酶蛋白酶3(caspase3)抗体为Oncogene产品(Darmstadt);兔抗人肌动蛋白(actin)抗体、化学发光底物检测试剂盒购自Santa Cruz;辣根过氧化物酶标记的抗兔及抗羊IgG购自中国中山生物技术公司;DNA纯化试剂盒购自Promega;RPMI1640和小牛血清购自Gibco。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人胃癌SGC7901细胞的培养 常规复苏人胃癌SGC7901细胞，按贴壁方法培养，培养基为RPMI Medium 1640，每100 ml含青霉素1万U,链霉素100 mg,胎牛血清15 ml，用灭菌的5.6% NaHCO3溶液调pH值至7.2。置于CO2孵箱，37℃、5% CO2条件下培养,细胞生长至近融合状态时,用0.25%胰酶消化传代，每周1～2次。

　　1.2.2 体外诱导法建立CDDP耐药的人胃癌细胞株SGC7901/CDDP 对数生长期的胃癌细胞株SGC7901用含CDDP 100 ng/ml的RPMI1640培养液培养2 w后，将细胞消化传代，用正常RPMI1640培养液悬浮细胞，细胞再次贴壁后形态恢复，将CDDP药物浓度提高到200 ng/ml，在此浓度下维持2 w;方法同上依次将药物浓度提高到300、400、500、1 000 ng/ml。在 1 000 ng/ml药物浓度下维持培养,初步得到SGC7901/CDDP细胞株。

　　1.2.3 OA对SGC7901/CDDP细胞增殖的影响 实验设对照组和OA处理组。OA处理组分别以终浓度为40、60、80和100 μmol/L处理细胞，细胞培养液中DMSO的终浓度≤0.05%。以5×107细胞/L，接种于96孔培养板中，每组均设3个平行孔，分别培养12、24、48和72 h。每孔加入3甲基四氢噻唑硫酮2(MTT)20 μl，孵箱内孵育4 h后，每孔再加入DMSO 200 μl，振荡10 min后，用酶标仪在波长490 nm处测定吸光度值,计算OA处理细胞的生存率(%)=(各实验组OD值/对照组OD值)×100%〔6〕，绘制细胞生长曲线。

　　1.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 每瓶接种1×106细胞,以100 μmol/L的OA处理细胞12～72 h;同时设空白对照组。收集细胞;加入 500 μl浓度为7 mol/L的盐酸胍溶解细胞，按照Promega公司的DNA纯化试剂盒收集DNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳分离DNA,溴化乙啶(EB)染色,凝胶成像系统成像。

　　1.2.5 Western印迹检测caspase3蛋白的活化 在实验开始前24 h,将细胞分瓶培养,密度为每瓶1×106细胞。以100 μmol/L OA分别处理细胞12～72 h;同时设空白对照组，离心，收集并裂解细胞;用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度;取50 μg 蛋白样品经15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳分离;转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉的Tris缓冲生理盐水吐温20T(TBST)封闭;加入 caspase3 (1∶100)Ⅰ抗及 1∶4 000 的辣根过氧化物酶 (HRP) 标记 Ⅱ 抗,采用 ECL 化学发光法曝光显影。

　　1.3 统计学方法 应用 SPSS 12.0分析数据,两组间比较采用t检验;MTT实验为析因设计，采用析因方差分析;所有假设检验以0.05为检验水准。

　　2 结 果

　　2.1 OA对SGC7901/CDDP细胞的生长抑制作用 MTT法检测表明同一时点不同浓度的OA对SGC7901/CDDP细胞的抑制作用随浓度的升高而增强;同一浓度OA在不同时点对细胞的生长抑制作用随时间的延长而增强，见图1。

　　2.2 DNA电泳结果 100 μmol/L OA处理SGC7901/CDDP细胞48 h后出现典型的DNA梯形条带，见图2。

　　细胞caspase3蛋白的活化2.3 OA对SGC7901/CDDP细胞caspase3蛋白活化的影响 用Western印迹检测caspase3的激活，发现药物处理48 h后，caspase3由前体降解为有活性的caspase3，见图3。

　　3 讨 论

　　本研究MTT实验结果证明，高浓度(60、80和100 μmol/L)OA在各处理时间都能够显著抑制SGC7901/CDDP细胞增殖。而低浓度(40 μmol/L)的OA在处理72 h才能抑制 SGC7901/CDDP 细胞的增殖;这一浓度的OA在处理12，24和48 h对SGC7901/CDDP细胞的增殖没有显著的抑制作用。琼脂糖凝胶电泳实验证实，对照组细胞和处理前期(12 h和24 h)细胞的 DNA 保持较好的完整性，而100 μmol/L的OA 48 h后，细胞的 DNA 出现明显的 DNA Ladder 图谱，这是细胞凋亡最显著的生物化学标志。结果也证明，OA抑制SGC7901/CDDP细胞增殖的方式为诱导细胞凋亡。

　　目前认为,所有的caspase均以无活性的酶原形式存在，一经激活将产生caspase级联反应，使细胞内重要的蛋白发生降解，并最终导致细胞凋亡。所以，检测细胞凋亡中caspase酶活性变化是一重要指标。根据N端前域的长短,可将caspase分为调控者caspase和效应者caspase，caspase3属于效应者caspase,被认为是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。本实验免疫印迹结果显示，以酶原形式存在的35 kD的 procaspase3在100 μmol/L的OA对SGC7901/CDDP细胞作用48 h和72 h，procaspase3 前体分子断裂为 17 kD 的活性片段(activecaspase3)，进而表现为一系列的生化方面的特征变化,这些变化是 caspases 介导的特异底物分解的直接结果〔7〕。

　　为阐明胃癌细胞对CDDP化疗耐药的机制，逆转临床耐药，在体外建立理想的胃癌CDDP化疗耐药细胞株则成为研究肿瘤耐药的细胞生物学变化的前提和基础。目前国内外建立肿瘤耐药细胞株的方法通常有3种，即药物浓度梯度递增持续作用法〔8～10〕、小剂量药物间歇诱导法〔11〕和大剂量药物间歇诱导法〔12〕。本研究采用药物浓度梯度递增持续作用法在体外建立了耐药细胞株SGC7901/CDDP。本研究结果表明，OA能够诱导CDDP耐药胃癌 SGC7901 细胞凋亡，其作用机制可能是OA通过线粒体途径而诱导细胞发生凋亡。本研究为临床胃癌的化疗和天然抗肿瘤药物的开发提供了理论和实验依据。

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