Rituximab对紫杉醇诱导人B淋巴瘤细胞株凋亡的增敏作用

　　作者：张红雨,管忠震,黄岩,张星,林桐榆 作者单位：1.519000 广东珠海，中山大学附属第五医院肿瘤化疗科;2.中山大学肿瘤防治中心

　　【摘要】 目的 基于对CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合化疗方案治疗侵袭性淋巴瘤疗效的不尽人意，本文研究利妥昔单抗(Rituximab)对新一代化疗药物Paclitaxel的化疗增敏作用，并探讨其可能的作用机制。方法 (1) 体外培养Daudi、Ramos、Namalwa和Raji细胞，采用XTT法测定细胞增殖抑制率：以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘出细胞增殖抑制曲线，比较单药和两药协同作用曲线，若联合作用曲线左移表示有协同作用，右移表示有拮抗作用。(2)Western blot测定：Daudi、Ramos、Raji和Namalwa细胞经Rituximab 20μg/ml作用24小时后检测抗凋亡蛋白Bcl2的表达情况。结果 (1) XTT法测定Paclitaxel单药及与Rituximab联合作用对各细胞株增殖抑制率：对Daudi、Namalwa、Ramos和Raji细胞株，Rituximab对Paclitaxel的细胞毒作用有明显的增敏作用;(2) Western blot测定：在Namalwa和Raji细胞株中，经Rituximab作用24小时后，可见Bcl2蛋白表达下调。结论 (1) 单药Rituximab对Paclitaxel有明显的化疗增敏作用。(2) 在Namalwa和Raji细胞株，经Rituximab作用24小时后可见Bcl2表达下调，可能是Rituximab增敏的机制之一。

　　【关键词】 美罗华;B淋巴瘤细胞株;增敏

　　Rituximabmediated Sensitiziation of BNHL Cell Lines to Apoptosis Induced by Paclitaxel

　　ZHANG Hongyu1， GUAN Zhongzhen2， HUANG Yan2,ZHANG Xing2,LIN Tongyu2

　　1.Department of Medical Oncology， Fifth Hospital Affliated Sun Yatsen University,Zhuhai 519000，China;2.Department of Medical Oncology， Cancer Center， Sun Yatsen University

　　Corresponding Author: LIN Tongyu，Email:tongyulin@hotmail.comAbstract：Objective It is unsatisfied to the efficacy for patients with aggressive NonHodgkin's lymphoma(NHL) were treated by CHOP regimen (cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,and predisone).In this research,we studied the Rituximabmediated sensitization of BNHL cell lines to apoptosis induced by Paclitaxel and discussed their mechanism.Methods (1)Detection of inhibitive rate of cell proliferation by XTT assay: the cytotoxic effect of each treatment was calculated as the percentage of viability as compared to the untreated cells.The curves of cell inhibiting are draw by the concentration of drugs set as abscissa and the rates of inhibition as ordinate.There are two curves of inhibition: one for cytotoxic drug and another one for combination in rituximab with Paclitaxel.Shifting left of curve imply the synergistic effect,while shifting right of curve means the agonistic effect.(2)Western blot analysis of protein expression: The human burkitt’s lymphoma cell lines Daudi,Namalwa,Raji and Ramos cells were cultured in complete medium supplemented with either rituximab(20 μg/ml) or normal serum for ninetysix hours.At different times,the cells were harvested and the expression of antiapoptosis protein Bcl2 was analyzed by westblotting.Results (1)Inhibition of cell proliferation by either Paclitaxel alone or combination with rituximab was detected by XTT assay: rituxiamb could sensitize significantly the cytotoxicity of Paclitaxel in Daudi,Namalwa and Raji cell lines.(2)Analysis of Westblotting: Expression of Bcl2 protein was downregulated after treated by rituximab for 24 hours in Raji and Namalwa cell lines.Conclusion (1)Rituximab as a monomer could sensitize the cytotoxicity of Paclitaxel to the human lymphoma cell lines.(2)Expression of Bcl2 in Raji and Namalwa cell lines was downregulated after the cells were treated by rituximab for 24 hours.Downregulation of Bcl2 expression might be the one of mechanisms which the rituximab sensitized the cytotoxicity of cytotoxic drugs.

　　Key words：Rituximab;BNHL cell line;Sensition

　　CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合化疗方案是目前治疗侵袭性淋巴瘤[1]，尤其是弥漫大B细胞型淋巴瘤的标准治疗方案，20世纪90年代发展的新一代细胞毒药物Paclitaxel开始作为二线或三线方案应用于复发或难治淋巴瘤的治疗并取得了较好的疗效。

　　Rituximab(利妥昔单抗,美罗华)是首个用于临床治疗NHL的单克隆抗体，和化疗药物联合应用，治疗侵袭性淋巴瘤，有效率超过80%[2]。体外试验[3]证明Rituximab在体外和传统的化疗药物在诱导淋巴瘤细胞凋亡时有协同作用，可逆转对传统细胞毒药物耐药现象，增加凋亡率。本研究采用体外培养淋巴瘤细胞株，观察Rituximab对Paclitaxel的增敏作用，初步探索Rituximab可能的作用机制，为临床联合应用Rituximab和Paclitaxel治疗淋巴瘤提供理论基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株与细胞培养

　　人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤细胞株Daudi、Namalwa、Raji、 Ramos为中山大学肿瘤防治中心实验研究部保存。用含10% 小牛血清(血清在使用前56℃ 30min灭活补体)、100u/ml青霉素和100μmol/L链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养。所有实验均在细胞对数生长期进行。

　　1.1.2 药品与试剂

　　Rituximab，为瑞士Hoffmann公司产品,保存浓度为10mg/ml，Paclitaxel(紫杉醇)，为施贵宝公司产品，保存浓度为6 mg/ml;

　　Bcl2鼠抗体、HRP偶联的抗鼠二抗、化学发光剂为Santa Cruzs公司产品。

　　GAPDH(甘油醛3磷酸脱氢酶)：上海康成生物公司产品。

　　DMSO(Dimethyl sulfoxide)和XTT[2,3bis(2methoxy4nitro5sulfophenyl)5 (phneylamino carbonyl)2Htetrazolium hydroxide]为SigmaAldrich公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 四唑氮氢氧化物 (XTT)法测定细胞生长抑制率

　　分别取对数生长期的人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤Daudi、Namalwa、Raji、Ramos细胞，稀释成细胞浓度为2×105/ml，加入96孔板中，每孔100μl。设生理盐水对照组和不同浓度的Rituximab单药组、Paclitaxel单药组以及Rituximab联合化疗药物组;单抗的浓度(终浓度)分别为1、5、20、80、320和1280μg/ml 6个浓度梯度;Paclitaxel浓度(终浓度)分别为0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50μg/ml 7个浓度梯度;联合用药组先加Rituximab 20μg/ml每孔作预处理，每组设3个平行孔，置于37℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h后加入化疗药物，再培养24 h终止实验。实验终止前3h加入20μl PMSXTT溶液(XTT终浓度为0.2mg/ml,PMS终浓度为20μmol)，再培养3h，用BioRad 550酶联免疫检测仪于450nm、655nm波长测每孔的OD值。测出OD值后按下列公式求出增殖抑制率。再按Bliss法计算程序，求出半数抑制浓度(IC50值)。抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。实验重复3次，取平均值。计算协同方法参见文献[3]：以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘出细胞增殖抑制曲线，比较单药和两药协同作用曲线，若联合作用曲线左移表示有协同作用，右移表示有拮抗作用。

　　1.2.2 Western blot测定

　　1.2.2.1 蛋白样本的制备 收集经Rituximab 20μg/ml作用(有文献报道[4]，Rituximab在20μg/ml时，诱导凋亡作用最强)24、48、72和96 h的人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤Daudi、Ramos、Raji和Namalwa细胞，PBS(4℃)洗涤2次，加入1×细胞裂解加样缓冲液，-20℃保存待测定。

　　1.2.2.2 Western blot测定 蛋白样本在上样前100℃煮5 min，取等量20μl进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，然后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST液封闭2 h(室温)，用含5%脱脂奶粉的TBST液稀释Bcl2一抗(1∶500;内参为GAPDH，分子量为36KD)4℃过夜， TBST液洗膜3次，每次10min，然后用含5%脱脂奶粉的TBST液稀释偶联HRP抗鼠二抗(1∶4000)，室温孵育2h，TBST液洗膜3次，每次10min，加入交联化学发光剂ECL(Western blot detection reagents)A液和B液(1∶1)的混合液，反应1 min，再放入暗盒并压片，底片显影、定影。

　　1.2.2.3 流式细胞仪检测 人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤细胞株Daudi、Ramos、Namalwa、Raji细胞分别放入6孔板，每孔细胞各约2×105/ml共10ml，分为对照、Rituximab 2、20和200μg/ml共4个组别，培养4天，分别在24、48、72和96 h各取5×105个细胞，PBS洗涤2次，70%乙醇固定过夜，加RNA酶消化，细胞经溴化丙啶(PI，10μmol/L)染色5 min，4℃避光表1 Paclitaxel对淋巴瘤细胞生长抑制的IC5030 min后，在流式细胞仪上用488nm激发光激发检测细胞DNA含量，LYSIS软件(Becton Dickinson公司产品)分析，求出细胞周期分布比率和凋亡率。

　　1.2.3 统计学方法

　　采用SPSS10.0作分析软件，加用Rituximab前后的抑制率用t检验;细胞周期分布间差异采用F检验;P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 XTT法测定Paclitaxel、Gemcitabine和NVB单药及与Rituximab联合作用对各细胞株增殖抑制率，见表1。

　　2.2 Daudi和Namalwa细胞株在Paclitaxel作用下的生长抑制曲线，见图1。

　　2.3 Western blot测定

　　人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤细胞株Daudi、Ramos、Namalwa、Raji细胞(Jurkat细胞作对照)经Rituximab在20μg/ml作用24小时后，分别测定各株细胞Bcl2蛋白表达情况：(各细胞株按Daudi、Namalwa、Raji、Ramos和Jurkat顺序排列，每株样品两孔，前为正常对照);在Namalwa和Raji细胞株中，经Rituximab作用24小时后，可见Bcl2蛋白表达下调，见图2。

　　2.4 流式细胞仪检测单药利妥昔单抗诱导淋巴瘤细胞凋亡

　　单药利妥昔单抗在低浓度和高浓度时对Daudi细胞无明显诱导凋亡作用，凋亡率在2%～10%左右，同空白对照相比，差异无统计学意义。Namalwa、Raji和Ramos细胞在利妥昔单抗浓度为2、20和200μg/ml时无明显凋亡作用，见表2。

　　3 讨论

　　Paclitaxel是来源于植物的新一代抗肿瘤药物[5]，被认为是抗瘤谱较广泛的药物之一，对多种实体瘤有较好的疗效，对NHL也有较好的疗效，但作为一线用药其疗效并不优于现有的NHL标准治疗方案[6]，所以更多情况下是用于NHL的二线或三线治疗;而且新一代药物同传统的化疗药物相比，也未能克服肿瘤细胞对细胞毒药物耐药的问题。显然，寻找方法克服耐药将有助于提高NHL的疗效。

　　Rituximab是一种人鼠嵌合的单克隆抗体[7]，1997美国FDA批准用于单药治疗CD20阳性的难治或复发和惰性BNHL，现渐采用和化疗药物联合应用治疗侵袭性BNHL，取得了令人满意的疗效[89]。在单药应用时，其主要的作用机制是ADCC(抗体依赖的细胞毒作用)[10]和CDC(补体依赖的细胞毒作用)[11]。但在和化疗药物联用时，其详细的作用机制还不十分明了。因细胞毒药物固有的血液学毒性，在白细胞明显减低时，ADCC和(或)CDC作用要受到明显影响，但临床疗效观察表明，Rituximab联用化疗药物治疗BNHL疗效明显优于单用化疗药物[9]。显然两者联用有协同效果;有学者推测[89]，单抗在联用时所表现出来的协同效果可能是：(1)其对瘤细胞的直接诱导凋亡作用;(2)单抗结合于细胞表面CD20抗原后影响细胞内信号传导系统。表2 流式细胞仪检测单价利妥昔单抗单药诱导各细胞株凋亡率

　　在本研究中，对人Burkitt’s非霍奇金淋巴瘤Daudi、Ramos、Namalwa和Raji细胞，由于血清被热灭活补体和未加入效应细胞，不能产生ADCC和CDC作用，单价单药Rituximab并无明显的诱导凋亡作用，仅对Daudi、Namalwa和Raji细胞有轻度抗增殖作用，体外增加单抗的浓度和增加作用时间不增加凋亡率。Ghetie等[12]研究认为，单价的Rituximab对Daudi、Raji、Ramos 、Namalwa和DHL4细胞株无明显诱导凋亡作用(最大凋亡率不超过6%)，但经抗IgG抗体交联成二聚体后可明显增加凋亡率，Daudi细胞凋亡率增加至32.2%;Ramos可达32.3%。Cardarelli等[13]研究也认为单价的抗CD20抗体在诱导细胞凋亡时需要二级抗体的铰链、抗体单体的二聚体或双价抗体的存在。本研究也表明单价未经交联的Rituximab体外对淋巴瘤细胞无明显诱导凋亡作用，与文献报道相符。

　　单药Paclitaxel对Daudi、Raji、Ramos 和Namalwa 4株细胞均有明显的生长抑制作用，在Daudi、Namalwa、Ramos和Raji细胞中，IC50分别为11.54、8.82、8.04和11.24;经Rituximab 20μg/ml预先作用24小时后，4株细胞的IC50分别为5.08、0.97、1.8和1.18，差异有统计学意义。表明利妥昔单抗对Paclitaxel有明显的细胞毒增敏作用，即Rituximab和Paclitaxel有很好的协同作用。Rose等[14]研究体外Rituximab和地塞米松相互作用时表明，同时应用单抗和地塞米松，对ADCC和CDC无明显影响，先用单抗预处理瘤细胞后再加地塞米松，CDC作用明显增强，ADCC作用稍减弱，细胞溶解明显增加，表明两者有较好的协同作用。本研究与文献报道相符。

　　本研究表明，经Rituximab作用24小时后，可诱导Raji和Namalwa细胞株下调Bcl2的表达，这可能是单抗能增敏细胞毒药物的作用机制之一。Vega等[15]以2F7细胞株为对象研究Rituximab在体外诱导凋亡作用，结果表明，Rituximab与CD20分子结合后，抑制p38 MAPK(mitogen activated protein kinase)活性，p38 MAPK通过下调NFκB活性而下调IL10的表达和分泌，再通过IL10/IL10R自分泌和(或)旁分泌途径导致抗凋亡基因Bcl2表达下调。

　　综上所述，单药Rituximab对Daudi、Namalwa、Raji和Ramos细胞株无诱导凋亡作用。Rituximab对Paclitaxel有明显的化疗增敏作用;在Namalwa和Raji细胞株，经Rituximab作用24小时后可见Bcl2表达下调，可能是单抗增敏的机制之一。

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