人多发性骨髓瘤耐药细胞系MOLP2/R的建立及其耐药机制

　　作者：肖晖，张克俭，左学兰

　　【摘要】 目的 建立耐马法兰的人多发性骨髓瘤细胞系MOLP2/R, 并对其生物学特性及耐药机制进行初步探讨。方法 采用马法兰浓度梯度递增法,建立耐马法兰多发性骨髓瘤细胞系。检测两种细胞的形态差异、生长曲线及倍增时间; 用药物敏感试验检测两种细胞对马法兰及多种化疗药物的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI);使用Western blot比较两种细胞Pgp、MRP和FANCD2的表达差异来探讨可能的耐药机制。结果 成功建立了耐药指数为6.03的MOLP2/R 耐药细胞系，与MOLP2细胞相比，MOLP2/R耐药细胞异形明显; 耐药细胞倍增时间显著延长(P<0.05) ; MOLP2/R且对ADM、CTX、DDP、VP16有交叉耐药; MOLP2/R中FANCD2的单泛素化表达较MOLP2明显增加，而Pgp、MRP在耐药细胞系中表达无升高。结论 MOLP2/R具有典型多药耐药特性 ,为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。FANCD2蛋白单泛素化表达增强可能是MOLP2/R细胞产生获得性耐药的主要机制之一。

　　【关键词】 多发性骨髓瘤; 马法兰;FA/BRCA(Fanconi anemia/BRCA)途径;耐药性;多药

　　Establishment of Melphalanresistant Multiple Myeloma Cell Line MOLP2/R and Its Multidrug Resistant Mechanisms

　　XIAO Hui, ZHANG Kejian, ZUO Xuelan

　　Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, ChinaAbstract：Objective To establish melphalanresistant cell line of human multiple myeloma MOLP2/R and to investigate its biological characteristics and possible mechanisms of acquired resistance.Methods Melphalanresistant cell line of multiple myeloma MOLP2/R was established by continuous stepwise selection in increasing concent ration of melphalan. Cell morphology, growth curve and population doubling time, protein level of Pgp, MRP and FANCD2 monoubiquitination were investigated to determine the biological features of MOLP2/R cell line. The IC50 and resistance index(RI) were measured by MTT assay.Results A melphalanresistant cell line MOLP2/R was successfully established . The resistance index (RI) of MOLP2/R cells was up to 6.03.Besides melphalan it was cross resistant to many other chemotherapeutic agents, such as ADM、CTX、DDP and VP16. Comparing with its parent cell line, the multiplication time was postponed (P<0.05) , but the proportion of S phase wasn't significantly higher than parent cell line(P>0.05). Western blot studies showed that the levels of Pgp, MRP expression in the MOLP2/R cells were similar with the sensitive cells, but enhanced FANCD2 protein monoubiquitination.Conclusion MOLP2/R cell line with stable melphalanresistance shows typical multidrug resistance phenotypes and may serve as an ideal model for exploring the mechanism of MDR and the new route of reversing multidrug resistance. Overexpression of FANCD2 protein monoubiquitination might contribute to acquired drug resistance in MOLP2/R.

　　Key words：Multiple myeloma; Melphalan; FA/BRCA(Fanconi anemia/BRCA)pathway; Drug resistance; Multiple

　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞恶性疾病，临床上将马法兰作为对MM一线治疗方案一直沿用至今，大多数MM患者在治疗初期对药物有较好反应，但最终都将因获得性耐药而复发。MM细胞多药耐药是导致MM治疗失败的主要原因。近来有研究发现MM 细胞耐药与DNA损伤修复密切相关[12]。但其具体机制及发生耐药途径仍不明确。建立理想的MM耐药细胞模型是深入研究MM细胞多药耐药机制的前提。我们采用浓度梯度递增法 ,建立了人MM马法兰耐药细胞系MOLP2/ R ,并对其生物学性状进行检测和鉴定,初步探索FA/BRCA途径中关键蛋白FANCD2单泛素化表达水平在耐药细胞系中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物和试剂

　　RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Gibco 公司。抗FANCD2及βactin抗体购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,CA)。马法兰、 顺铂(Cisplatin，DDP)、硫酸长春新碱(Vincristine, VCR)、MTT均购自Sigma公司。阿霉素(Adriamycin，ADM)、阿糖胞苷(Arac)购自浙江海正药业有限公司。环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、足叶乙甙(VP16)购自江苏恒瑞药业有限公司

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 诱导建立耐药细胞系

　　人多发性骨髓瘤细胞系MOLP2购自德国微生物及细胞培养中心(DSMZ)，在37℃ 、5%CO2条件下, 用含10%胎牛血清、4nmol/L左旋谷氨酸、1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养液传代培养。采用逐渐增加MOLP2细胞培养液中马法兰浓度的方法诱导建立耐药细胞系。马法兰在耐药细胞培养液中起始浓度为0.25 μmol/L, 每2周时间增加浓度0.25 μmol/L，体外连续培养细胞40周后获得的马法兰耐药细胞系, 马法兰在耐药细胞培养液中终浓度为5μmol/L。将此耐药细胞系命名为MOLP2/R。以正常人原始淋巴细胞系HSC93及来自于已知范可尼贫血F型(Fanconi anemiaF，FAF)患者的原始淋巴细胞系VU698作为实验对照[3]，以上两种细胞系由荷兰自由大学Joenje教授惠赠，培养方法同MOLP2细胞系。

　　1.2.2 细胞形态学观察

　　取对数生长期的细胞 ,以5×105/ml浓度细胞涂片后 ,进行 Giemsa染色 ,观察细胞形态结构。取对数生长期的亲代细胞MOLP2和耐药细胞MOLP2/R,在透射电镜下观察细胞超微结构。

　　1.2.3 细胞生长曲线和群体倍增时间( TD)的测定

　　以细胞密度2×104 /ml接种在24孔细胞培养板中,每孔1 ml,置37 ℃,5%CO2 温箱中培养, 连续7 d ,每天计数3孔细胞,取均值。绘制细胞生长曲线,按Patterson公式,计算细胞在对数生长期的TD= Tlg2/ lg ( N/ N0 ) , T为培养时间, N为该时刻的细胞数, N0为起始细胞数。

　　1.2.4 药敏实验

　　用MTT法检测MOLP2和MOLP2/R细胞对马法兰、ADM、VCR、CTX、Arac、VP16及DDP的敏感性。实验前两周MOLP2/R细胞在不含马法兰的培养液中培养后备用。取对数生长期的MOLP2和MOLP2/R细胞,用RPMI1640培养液制成单细胞悬液, 接种到96孔板(细胞浓度为每孔2×104)，48 h后分别加入不同浓度化疗药物,每一浓度平行3孔。培养48 h后弃去上清液,每孔加5 mg/ ml的MTT液20 μl ,继续培养4 h后小心弃去上清液,每孔加200 μl DMSO ,避光振荡10 min 使结晶物充分溶解。用酶标仪测570 nm波长各孔吸光度OD值,对照孔为不含血清的RPMI 1640 培养液。 以药物浓度为横轴, 细胞存活率为纵轴, 绘制浓度-效应曲线, 确定半数抑制浓度(IC50)，计算耐药指数(RI)=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。

　　1.2.5 细胞周期分布及DNA含量测定

　　取对数生长期的亲代细胞和耐药细胞1×106个PBS清洗。 制备单细胞悬液, 322 g (1 200 r /min)离心5 min, 弃上清。 重新悬浮于2 ml 染色液(0.15 mol/L NaCI; 0.1 mol/L Tris/HCI; 0.5 mmol/L MgCl2 ; 1.0 mmol/L CaCl2 ; 0.1% Igepal; 0.002% BSA)室温孵育15 min。加入20 μl的Hoechst stock (1 mg/ml) 4 ℃孵育至少15 min后在流式细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)上进行细胞周期分析。

　　1.2.6 Pgp 、MRP及FANCD2表达的测定

　　采用Western blot方法。取对数生长期的细胞, 加入RIPA (RadioImmunoprecipitation Assay, 美国Pierce ) 裂解液。冰上静置10min后,以4℃, 20 800 g(14 000 r/min)离心10 min后取上清。采用BCA法(BCA protein assay reagent kit, 美国Pierce)进行蛋白定量后, 蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混匀, 置于沸水浴中加热10min。蛋白样品(每孔上样量均为20 μg总蛋白)于SDSPAGE凝胶(3%～8% Trisacetate gradient gel, Invitrogen公司产品)进行电泳分离, 分离的蛋白条带转移至PVD膜并分别与抗人Pgp、MRP、 FANCD2及βactin的第一抗体于4 ℃孵育过夜后,再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体反应, 并用ECL Western blot分析系统(Amersham Pharmacia Biotech 公司产品)检测并显影。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS10.0软件包, 数据以±s表示, 统计学方法采用两样本均数比较的t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定

　　细胞生长曲线显示，MOLP2和MOLP2 /R在6～7天达到峰值, TD分别为(32.9±2.6) 、(48.7±3.1)h, 耐药细胞倍增时间比亲代细胞延长了44.5 %,MOLP2/R生长增殖明显减慢(P<0.05)。MOLP2和MOLP2/R的生长曲线见图1。

　　2.2 细胞的形态学观察

　　耐药细胞体积大小不一致,形态不规则,胞浆较丰富,核小而不规则,可见巨核现象，伪足及胞浆中黑色颗粒增多明显;而亲代细胞呈圆形,大小一致,核圆形,胞浆清亮,分布均匀。

　　2.3 Pgp、MRP及FANCD2的表达

　　Pgp、MRP在亲代细胞和耐药细胞中均为阴性表达，提示耐药细胞的耐药发生机制与Pgp、MRP的高表达无关。FANCD2单泛素化在耐药细胞中表达明显增强，提示这种耐药性的发生可能与FA/BRCA途径活性增强相关，见图2。

　　2.4 细胞周期检测

　　因为FANCD2单泛素化主要发生于G1～S期，我们用流式细胞仪检测MOLP2/R细胞是否阻滞于G1S期来寻求这种FANCD2单泛素化表达增强的原因。流式细胞仪检测细胞周期G1、S、G2/M 期细胞，发现MOLP2/R与MOLP2细胞相比, G1～S期耐药细胞比例高于亲代细胞, 但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 MOLP2和MOLP2/R细胞周期的比较(%)

　　2.5 MOLP2/R的RI及其交叉耐药情况

　　除对马法兰耐药外,还对ADM、CTX、DDP、VP16有交叉耐药, 而对Arac、VCR无交叉耐药性，仍保持与亲代细胞相似的敏感性，见表2。MOLP2 /R在不含马法兰的培养液中反复传代培养10周后耐药性稳定, RI为6.01。12周后测耐药指数降为5.35，需重新加入5 μmol/L的马法兰培养，仍获得相同的耐药性，测耐药指数为6.07。表2 MOLP2 /R细胞耐药谱

　　3 讨论

　　诱导耐药的过程实际上也是一个筛选细胞的过程, 由于细胞具有异质性,大部分敏感细胞被杀死,少数不敏感细胞存活下来并得以扩增。本实验采用在培养液中渐进式给药法, 在体外采用马法兰诱导培养人多发性骨髓瘤细胞系MOLP2。建立了MOLP2耐药细胞系，对马法兰的相对耐受度较亲代细胞提高了6.03倍, 与亲代细胞相比, 耐药细胞生长速度减慢，细胞体积无明显变化，是一种继发性耐药细胞系, 具有多药耐药特性, 对CTX、ADM、DDP等结构及作用机制不同的多种化疗药物存在不同程度交叉耐药, 对Arac、VCR无交叉耐药现象。一般认为耐药指数小于5 为低度耐药,耐药指数5～15 为中度耐药,耐药指数大于15为高度耐药[4]。这说明本研究建立了中度耐药的MOLP2 /R多药耐药细胞系,是研究马法兰耐药机制及筛选逆转剂的理想模型。

　　研究表明，多种途径参与MDR的发生，包括一些细胞内因子，如TNF、IL2等增强DNA的修复作用[56]及DNA异常修复引起的MDR[7 ]。已发现FA/BRCA(Fanconi anemia/BRCA)途径在DNA损伤修复过程中起重要作用[89 ]，多种FA基因编码的蛋白通过共同的机制 FA/BRCA(Fanconi anemia/BRCA)途径维持细胞基因组的稳定，至少八种FA蛋白(A,B, C, E, F, G, L和M)相互作用组成一个FA蛋白核心复合物，该复合物通过促进FANCD2单泛素化来激活FANCD2，活化的FANCD2在FA复合物下游发挥作用。多种DNA交联剂通过该途径发挥效应, 已证实在卵巢癌中DDP的获得性耐药与FA/BRCA途径的再活化有关[9]。甚至在对乳腺癌行CTX和阿霉素联合化疗中,发现有FA/BRCA途径的一种组成蛋白FANCG的表达上调[10]。在临床常用化疗药物中有多种药物为DNA交联剂，如丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)、DDP、CTX、马法兰等, 被广泛用于多种实体瘤及血液系统肿瘤的治疗。FA/BRCA途径可调节对DDP及其他DNA交联物质所产生的细胞内反应[11]。本实验结果也证实FANCD2单泛素化在多发性骨髓瘤耐药细胞MOLP2 /R中表达明显增强，提示这种耐药性的发生可能与FA/BRCA途径活性增强相关。

　　综上所述，恶性肿瘤化疗药物中常用的一类DNA交联剂很可能是通过作用FA/BRCA途径来发挥作用，而其继发耐药可能与该途径的活性增强有关。这提示我们可通过抑制该途径的活性来达到增强化疗药物作用及解除耐药。

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