羟基脲诱导的K562细胞分化中PBK/TOPK的表达变化及其意义

作者：刘宇宏    作者单位：716000 陕西延安大学附属医院血液科     【摘要】  目的 研究PBK/TOPK在HU(羟基脲)诱导白血病细胞K562的分化时的表达及意义。方法 用不同浓度的羟基脲对K562细胞进行诱导分化实验，通过联苯胺、吉姆萨瑞氏染色和流式细胞仪证实其分化方向；用Western blot法检测PBK/TOPK在K562细胞分化前后表达的变化。结果 400μmol/L的羟基脲对K562作用4d后具有良好的诱导分化效果，并诱导其向红系分化，且PBK/TOPK在K562细胞向成熟分化后表达不变，而PhoPBK/TOPK和Phop38有少量增加。结论 HU能抑制白血病细胞K562的增殖,并诱导其向红系分化,在此过程中，有激活的PBK/TOPK参与，推测很可能通过磷酸化下游分子p38而起作用。

    【关键词】  K562细胞 PBK/TOPK 细胞分化 羟基脲

    白血病是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，我们对它的治疗主要采取传统的放化疗。近年来，人们陆续发现，在一些药物的诱导作用下，肿瘤细胞可以向成熟方向发生分化，有的出现类似正常组织细胞的表型，有的甚至还恢复了正常细胞的某些功能。这为抗肿瘤治疗开辟了一条新途径。本实验中我们建立了HU诱导的K562向红系分化模型，研究PBK/TOPK信号转导分子在分化机制中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    人急性髓细胞白血病细胞株购自美国ATCC公司，由本室保存。PBK/TOPK和PhoPBK/TOPK（均为兔抗人多克隆抗体），Phop38（兔抗人单克隆抗体）为美国Cellsignal technology公司产品，羟基脲(HU)购自Sigma公司，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,联苯胺为Promega公司产品,Western blot检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养将培养至对数增殖期K562细胞分3组(2组用于制备分化模型，1组用于对照)，每组细胞5×104，分别接种于含10胎牛血清的RPMI

    图1  诱导分化前的K562细胞（×200）  图2  诱导分化后的K562细胞（×200）

    1640培养液中，于37℃、饱和湿度、5%  CO2孵箱培养。

    1.2.2  K562细胞向红细胞系分化模型的制备  分别按照文献[1]方法复制K562细胞向红细胞系分化模型，即用HU  200μmol／L和400μmol／L分别诱导K562细胞4d，对照组细胞仅加入相应体积RPMI 1640培养液。每天记录细胞数。

    1.2.3  K562细胞红系分化的检测  利用常规联苯胺染色、吉姆萨瑞氏染色、流式细胞仪等方法证实K562细胞分化方向。

    1.2.4  Western blot法检测PBK/TOPK、PhoPBK/TOPK和Phop38表达变化  诱导K562细胞4d后，分别收集各实验组及对照组细胞，冷PBS洗涤细胞2次，离心(1000 g×5min)，弃上清，提取各组细胞总蛋白质，用紫外分光光度仪进行蛋白质定量，并将各组蛋白质浓度稀释为1μg／μl，按Western blot检测试剂盒说明检测各实验组及对照组K562细胞PBK/TOPK蛋白表达情况。简述步骤如下：各组总蛋白进行80g／L SDS聚丙烯酰胺凝胺电泳(PAGE)，电泳带转印至PVD膜将膜浸入5%脱脂奶粉封闭1h，加入1∶800稀释的PBK/TOPK、PhoPBK/TOPK和Phop38 (4℃，过夜)，TBST洗膜，生物素化的羊抗兔IgG二抗37℃温育1h，TBST洗膜后DAB显色至条带清晰。PBK/TOPK、PhoPBK/TOPK和Phop38相对分子量为43KD。

    1.3  统计学方法

    以上实验均重复3次，数据采用SPSS 10．0统计软件分析。率的比较用χ2检验。

    2  结果

    2.1  HU诱导的K562细胞形态学改变

    对照组K562细胞胞体较大,大小不等，圆形，周围有许多不规则瘤状突起，胞核大，染色质疏松，核仁清晰易见。400μmol/L  HU诱导细胞4d后,K562细胞体积减小,核浆比例减低，核仁变的模糊甚至消失,核染色质由疏松趋向致密，核形态扭曲折迭或分叶，胞质趋向成熟改变（见图1、2）。

    2.2  联苯胺染色阳性率的变化

    以不加任何处理因素的K562细胞作为对照组， 进行联苯胺染色细胞内含血红蛋白时， 联苯胺染色着蓝色为联苯胺阳性细胞， 不着色为阴性细胞， 光镜下计数200个细胞， 计算联苯胺阳性细胞。 400μmol/L  HU诱导K562细胞4d后, 联苯胺染色阳性细胞数增至（39.12±4.87）%与K562单独培养对照组(5.75±1.23)%相比明显升高(P＜0.05)。

    2.3  细胞周期的改变

    流式细胞仪检测结果显示，K562细胞在400μmol/L的HU作用下，发生G0/G1期阻滞。G0/G1期细胞由对照组的58.3％（见图3） 增加到的82.5％(P<0．05)（见图4）。

    2.4  Western blot方法检测K562细胞向红系分化时PBK/TOPK、PhoPBK/TOPK和Phop38表达情况

    诱导K562细胞4d后，提取各组细胞总蛋白，Western blot检测发现，对照组和400μmol/L  HU诱导K562细胞向红系分化时，PBK/TOPK表达无明显差异,而PhoPBK/TOPK和Phop38表达少量增加(见图5)。

    3  讨论

    K562细胞是来自慢性粒细胞白血病急性变的

    图5  K562细胞向红系分化前后蛋白的表达变化

    细胞系， 在不同诱导因素作用下可向巨核系、 红系或单核/巨噬系统分化， 提示K562细胞可能是异常的造血祖细胞。 我们通过细胞瑞氏吉姆萨、 联苯胺染色， 细胞周期分析证实了羟基脲可诱导K562细胞向红系分化。 我们知道， 丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase， MAPK)包含3个成员： ERK（extracellular signalregulated）、 JNK（Jun Nterminal kinase）及p38MAPK ， 在肿瘤细胞的分化和凋亡中起调控作用， 多种药物通过激活或抑制MAPKs信号转导系统来调节肿瘤细胞的分化和凋亡过程[2]。 而PBK/TOPK是MAPKK家族新的成员， 系统进化树显示它是MEK1/2和MKK7之间的分支。 PBK/TOPK是一种丝/苏氨酸激酶， 在有丝分裂期间活化及磷酸化[3]。 它由激酶的亚结构域和1个碳末端的锌指结构结合域组成， 被认为和肿瘤抑制因子hDig相互作用， 最早发现在Burkitt淋巴瘤高表达。 造血系统恶性肿瘤的PBK/TOPK的强表达与磷酸化的Cmyc的高表达密切相关， 说明PBK/TOPK参与了细胞的恶性增殖[4]。 侵袭性淋巴瘤中PBK/TOPK的表达显著高于惰性淋巴瘤也表明了PBK/TOPK和细胞的恶性增殖密切相关[5]。 PBK/TOPK的活性在终末分化的HL60细胞中显著减低， 表明PBK/TOPK可以作为血液肿瘤细胞分化的指标之一。 长期以来， 我们对MAPK通路在K562分化时的细胞信号转导机制尚不清楚， 体外的研究已经表明P38MAP激酶是PBK/TOPK激酶活性的一种底物，  PBK/TOPK可以使P38MAPK磷酸化， 但并不磷酸化ERKI/2或JNK[6]。 研究表明在HL60细胞分化末期， 甚至在PBK/TOPK表达缺失时， P38仍保持在恒定水平， 可见PBK/TOPK信号的磷酸化与P38 水平高低的联系还存在其他相关细胞因子调节。 在HL60细胞内PBK/TOPK和P38的变化， 可能是其他的MAPK激酶上调激酶（如MKK3 和 MKK6）在保持磷酸化P38的水平过程起到了重要作用[7]。

    实验证实，在TPA诱导的HI60细胞向粒系分化过程中，PBK/TOPK表达量减少，这和国外文献报道一致，但磷酸化的PBK/TOPK少量增加[8]。本次实验又得出PBK/TOPK在K562细胞分化前后表达没有差异，但它的活化形式PhoPBK/TOPK在分化后表达含量增加，同时，磷酸化P38的表达含量也增加，说明在血液系统恶性肿瘤中，PBK/TOPK水平与白血病细胞的分化及生长俘获存在不确定关系。HU诱导的K562细胞向红系分化仍处于较早期水平，还未分化到终末期的成熟细胞水平；PBK/TOPK在信号转导过程中的作用依细胞类型而定，激活的PBK/TOPK对HU诱导的K562细胞向红系分化起一定作用，很可能通过下游分子P38磷酸化来实现。磷酸化的PBK/TOPK和磷酸化的P38少量增加提示在白血病分化的复杂过程中，可能存在多种相关因子的调节，或者还有其他的分化途径，致使PBK/TOPK的表达呈相反的现象。本研究为今后临床治疗白血病提供了有价值的策略和线索。

【参考文献】［1］ Park JI,Choi HS,Jeong JS,et al.Involvement of P38 kinsde in Hydroxyureainduced differentistion of K562 cells[J].Cell Growth Differ,2001,9(12):481486.

［2］ Miranda MB，McGuire TF，Johnson DE．Importance of MEK1/2 signaling in monocytic and granulocytic differentiation of myeloid cell lines[J]．Leukemia，2002，16(4)：683692.

［3］ SimonsEvelyn MK,Bailey D,Toretsky JA,et al.PBK/TOPK is a novel mitotic kinase which is upregulated in Burkitt's lymphoma and other highly proliferative malignant cells[J].Blood Cells Mol Dis, 2001,27(5):825829.

［4］ Cote S,Simard C,Lemieux R.Regulation of growthrelated genes by interleukin6 in murine myeloma cells[J].Cytokine,2002,20(3):113120.

［5］ 刘宇宏，刘延香，黄高昇，等.PBK/TOPK与B细胞非霍奇金淋巴瘤增殖活性的关系[J].临床与实验病理学杂志，2006，22（5）：541544.

［6］ Nandi A,Tidwell M, Karp J,et al.Protein expression of PDZbinding kinase is upregulated in hematologic malignancies and strongly downregulated during terminal differentiation of HL60 leukemic cells[J].Blood Cells Mol Dis, 2004,32(1): 240245.

［7］ Abe Y, Matsumoto S, Kito K, et al. Cloning and expression of a novel MAPKKlike protein kinase, lymphokineactivated killer Tcell originated protein kinase, specifically expressed in the testis and activated lymphoid cells[J].J Biol Chem, 2000, 275(28):2152521531.

［8］ 刘宇宏，王哲，刘延香，等.PBK/TOPK在TPA诱导的人HL60细胞分化中的表达及意义[J].第四军医大学学报,2007,28(4):300302.