环氧合酶2特异性siRNA真核表达质粒对HT29细胞生长的影响

环氧合酶2特异性siRNA真核表达质粒对HT29细胞生长的影响作者：王磊，陈卫昌，杨吉成    作者单位：江苏苏州大学附属第一医院消化科；2.苏州大学医学院细胞与分子生物学教研室    【摘要】  目的 探讨环氧合酶2（COX2）特异性小干扰RNA（siRNA）真核表达质粒对人结肠癌HT29细胞COX2表达和生长的影响。方法 设计短发夹结构的COX2 siRNA对应模版DNA序列，构建重组质粒pshCOX2。将重组质粒转染人结肠癌HT29细胞，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Western 印迹分别从mRNA和蛋白水平检测COX2表达。用四氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪观察COX2表达被抑制后细胞的生长情况，放射免疫法(RIA)和ELISA法分别检测培养上清中PGE2和VEGF的含量变化。结果 酶切及测序证实质粒pshCOX2构建成功。转染重组质粒72h后可以显著抑制HT29细胞COX2 mRNA和蛋白表达(P<0.05)，细胞生长受抑，凋亡细胞数显著增加(P<0.05)，细胞PGE2和VEGF的产生受抑制（P<0.05）。结论 成功构建的COX2 siRNA真核表达质粒pshCOX2通过抑制人结肠癌HT29细胞COX2基因表达，从而抑制细胞生长、PGE2合成和VEGF的产生。    【关键词】  环氧合酶2；siRNA；RNA干扰；真核表达质粒；结肠癌    Effect of Eukaryotic Expression Plasmid for Cyclooxygenase2 Specific siRNA on Growth of HT29 Cells in vitro    WANG Lei1，CHEN Weichang1，YANG Jicheng 2    1. Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of  Soochow   University，Soochow   215006，China；2. Department of Cellular and Molecular Biology, Soochow University    Corresponding Author：CHEN Weichang，Email：weichangchen@126.comAbstract：Objective   To investigate the effect of the eukaryotic expression plasmid of specific small interfering RNA (siRNA)against COX2 gene on the COX2 expression and growth of human colon cancer HT29 cells. Methods  The COX2 siRNA template DNA sequence for short hairpin RNA (shRNA) was designed and synthesized. The recombinant plasmid (pshCOX2) was transfected into HT29 cells. The effect of the recombinant plasmid on the COX2 expression of human colon cancer HT29 cells was detected by RTPCR and Western blot. Changes of the cell growth activity in response to transfected plasmid were evaluated by MTT assay and FCM. The methods of RIA and ELISA were respectively used to estimate the content of PGE2 and VEGF in supernatant. Results  It was confirmed by restrictive enzyme digestion and sequence analysis that the recombinant plasmid was cloned and the aim sequence was obtained. The COX2 expression of HT29 cells was inhibited at mRNA and protein levels 72 hours after transfected with the recombinant pshCOX2. The growth of HT29 cells was inhibited and the apoptotic ratio was significantly highly in COX2 siRNA transfected group than those in control groups(P<0.05). The content of PGE2 and VEGF in supernatant decreased significantly by transfecting pshCOX2. Conclusion  COX2 siRNA expression plasmid pshCOX2 successfully constructed can inhibit the expression of COX2 gene，proliferation and synthesis of PGE2 and VEGF of HT29 cells.    Key words：Cyclooxygenase2；siRNA；RNA interference；Eukaryotic expression plasmid；Colon cancer    RNA 干扰(RNA inference RNAi) 是近年迅速发展起来的一项新的基因功能研究手段，它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA)，即小干扰RNA(siRNA)，转染靶细胞，促进靶基因mRNA降解，从而特异性诱导转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）[1] 。但化学合成siRNA 成本太大且作用时间短暂，一般仅为数个细胞周期，不能完全满足长期实验研究的要求。2002年Brummelkamp等[2]首次报道，将siRNA 所对应的模板DNA 双链序列克隆入质粒转染细胞，DNA 模板在细胞内转录成小片段发夹状RNA ( shRNA)，这种shRNA与化学合成的siRNA具有相同的基因封闭作用，但作用时间可以长达2个月。因此我们构建针对结肠癌中高表达基因COX2 的siRNA 表达质粒，将其转染人结肠癌HT29细胞，观察其对HT29细胞COX2表达和生长的影响，为探讨结肠癌中COX2基因的功能提供新的手段。1  材料与方法    1.1  主要试剂    总RNA提取试剂和RTPCR试剂盒购于Fermentas公司；转染试剂lipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；COX2多克隆抗体购于Cayman Chemical公司；COX2引物及内参βactin引物由上海生工程公司合成，COX2 siRNA转录模版及质粒pGPH1GFPNeo由上海吉玛公司提供。人VEGF ELISA试剂盒购于上海精美公司，PGE2测定试剂盒由苏州大学血液病研究所提供。    1.2  COX2 siRNA序列的设计    按照siRNA设计原则[34]，利用Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”，根据NCBI数据库中COX2基因(Gene Bank 编号 NM000963)cDNA，设计了针对COX2cDNA 1 689～1 707位置碱基序列的19nt的DNA片段，经Blast Search 检索确认与COX2以外的人类已知基因序列无同源性。序列如下：sense5′GGA CTT ATG GGT AAT GTT A3′，anti sense 5′TAA CAT TAC CCA TAA GTC C3′。    1.3  COX2 siRNA表达质粒的构建和鉴定    1.3.1  shRNA转录模版DNA的设计  根据前面设计的siRNA序列，设计总长度为58nt的模版DNA链2条，由上海吉凯公司合成。其顺序为BbsⅠ酶切位点、19 nt正义序列、9 nt loop接头序列、19 nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ中止子（6个T）、BamHⅠ酶切位点。其序列为：正义：5′CAC CGG ACT TAT GGG TAA TGT TAT TCA AGA GAT AAC ATT ACC CAT AAG TCC TTT TTT G3′，反义：3′CCT GAA TAC CCA TTA CAA TAA GTT CTC TAT TGT AAT GGG TAT TCA GGA AAA AAC CTA G5′。    1.3.2  质粒pshCOX2的构建  pGPH1GFPNeo质粒，其RNA聚合酶Ⅲ启动子为人H1启动子，抗性标记为卡那霉素和新霉素。先将两条模版单链退火处理。对于pGPH1GFPNeo质粒进行BbsⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳，胶回收线性化质粒，利用T4 DNA连接酶把退火的shRNA模版DNA定向克隆至pGPH1GFP Neo质粒H1启动子之后，构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选卡那霉素抗性克隆，大量扩增摇菌后，抽提质粒纯化，命名为pshCOX2。    1.3.3  重组子的鉴定  利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ将质粒pshCOX2双酶切成两条片段，电泳观察插入子及载体片段的分子量。重组质粒序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。    1.4  细胞培养及转染    人结肠癌细胞株HT29购自于中国科学院上海细胞生物研究所，细胞接种于含有10%灭活胎牛血清、1%谷胺酰胺和1×抗生素混和液的McCoy′s 5A (购于GiBco公司)培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。在6孔板上加入4×105个/孔HT29细胞，在无抗生素含血清培养液中孵育过夜，质粒以每孔5μg与250μl无血清培养液配制成混和液，以及12.5μl LipofectamineTM 2000与250μl无血清培养液配制成混和液，两种混合液分别于室温下孵育5min后混和，再于室温孵育20min后加入无血清和抗生素细胞培液中，6h后更换为全培养液，48h后于荧光显微镜下观察转染情况。阴性siRNA质粒为阴性对照组，PBS液代替质粒为空白组。    1.5  RTPCR测定COX2 mRNA    转染24、48、72h和1周后分别收集6孔板中各组细胞，RTPCR法扩增各组细胞中COX2 mRNA，COX2上游引物5′TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT3′，下游引物为5′AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT3′。反应条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸30s，共32循环，产物最后72℃再延伸5min。使用βactin作为内参，上游引物为5′GAAACTACCTTCAACTCCATC3′，下游引物为5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC3′。扩增的COX2产物长度为305bp，βactin长度为219bp。取扩增产物10μl，加溴酚蓝1μl，在含溴乙啶的1.0％琼脂糖凝胶中电泳分离后，凝胶扫描仪进行电泳条带强度分析，使用BioCaptMW软件测出COX2/βactin的值作为表达水平的参数。    1.6  Western blot检测COX2蛋白表达    收集各组的HT29细胞1×107，提取总蛋白，上样经10％SDSPAGE分离胶和5%的SDSPAGE浓缩胶，分别与90V恒压电泳约2h，60V恒压电泳约90min，再与110V 恒压1.5h电转移至硝酸纤维素膜上，随后封闭过夜。用兔抗人COX2蛋白多克隆抗体（1∶1 000）加在中室温下杂交2h，洗膜后加入羊抗兔二抗IgG（1∶2 000）抗体，室温下摇动1h。ECL显色，暗室曝光X线片，胶片进行拍照，记录结果。    1.7  MTT法检测转染重组质粒对HT29细胞生长的影响    对数生长期的HT29细胞以1×104/孔接种于96孔板中常规培养24h后，加上转染因素，每组设3个复孔，并设空白对照组，阴性对照组，继续培养1～7d，每孔分别加入5g/L的MTT 10μl，37℃孵育4h后，每孔均加入10%SDSCl 100μl，轻微振荡使紫蓝色沉淀溶解，用酶标仪测定A570nm。    1.8  流式细胞仪检测重组质粒对HT29细胞凋亡的影响    对数生长期的HT29细胞以4×105/孔接种于6孔板中常规培养24h后，加上转染因素，设空白对照组，阴性对照组。72h后收取细胞，PBS洗涤2～3次，70%酒精固定后，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。    1.9  RIA法测定细胞上清中PGE2含量    对数生长期的HT29细胞以4×105/孔接种于6孔板中常规培养24h后，加上转染因素，设空白对照组，阴性对照组。分别于24、48和72h后收取细胞培养液上清，放免法测定PGE2含量（以pg/ml表示）。    1.10  ELISA法测定细胞上清中VEGF含量    对数生长期的HT29细胞以4×105/孔接种于6孔板中常规培养24h后，加上转染因素，设空白对照组，阴性对照组。分别于24、48和72h后收取细胞培养液上清，ELISA法测定VEGF含量（以pg/ml表示）。    1.11  统计学方法    所有数据采用SAS 8.0统计软件包进行统计学分析，数据均以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2.1  COX2 siRNA真核表达质粒的鉴定    pshCOX2经过酶切后电泳，可观察到在5000bp和100bp左右各有一条带，符合pGPH1GFPNeo质粒（5075bp）及插入的shRNA片段（58bp）的特征，见图1。测序证实与设计的短发夹结构的COX2 siRNA对应模版DNA序列相同，表明重组质粒中已经含有可以转录siRNA模版DNA片段。    2.2  重组质粒转染细胞观察    质粒中含有编码GFP的基因，故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光，见图2，转染效率可以达到80％以上，证实重组质粒在HT29细胞内已经有表达。    2.3  转染重组质粒对COX2 mRNA表达的影响    空白对照组和阴性质粒转染组在转染后24、48、72h和1周时细胞COX2 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），转染重组质粒的HT29细胞与空白对照组相比在转染24和48h后COX2 mRNA表达未受明显影响，而72h和1周时 HT29细胞的COX2 mRNA表达水平显著低于空白对照及阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05），见表1、图3。结果表明转染重组真核表达质粒可以显著抑制HT29细胞COX2mRNA表达。    2.4  转染重组质粒对细胞COX2 蛋白表达的影响    转染重组质粒72h后，提取各组HT29细胞蛋白运用Western blot检测COX2蛋白表达，见图4，结果发现重组质粒转染组细胞的COX2蛋白表达显著低于空白对照和阴性对照组，结果与RTPCR一致。    2.5  MTT法检测重组质粒对HT29细胞生长的影响 表1  重组质粒对细胞COX2 mRNA表达的影响 MTT法检测各组细胞的A值，见表2，图5，转染重组质粒后与空白和阴性对照相比，在24h时细胞生长未受到明显影响（F=0.14，P=0.8721），在转染48h后细胞生长开始受到抑制（F=17.68，P=0.0031），72h后抑制作用比较明显（F=43.14，P=0.0003），抑制作用可以持续至1周（F=344.59，P=0.0001）。    2.6  转染重组质粒后对HT29细胞凋亡的影响    HT29细胞转染重组质粒72h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，见图6。空白对照组和阴性对照组的细胞周期大部分处于G1期，细胞生长分裂正常，而转染重组质粒的HT29细胞有明显的凋亡峰（SubG1峰），三组的凋亡率分别为（0.3000±0.2000%），（0.2667±0.2082%）和（7.0667±2.3459%），重组质粒组明显高于各对照组（F=24.71，P=0.0013），说明转染COX2 siRNA重组质粒可直接诱导HT29细胞的凋亡。表2  MTT法检测转染后各组细胞的A值    2.7  RIA法检测转染后培养液上清中PGE2变化    测得转染后24、48和72h各组细胞培养上清中PGE2的含量，见表3，结果发现重组质粒组与对照组比较，转染24h后PGE2没有明显变化（F=0.29，P=0.7552），而从48h开始含量下降（F=11.71，P=0.0085），72h下降明显（F=82.23，P=0.0001），差异有统计学意义。表3  各组细胞不同时间上清中PGE2（pg/ml）的比较　　2.8  ELISA法测定细胞培养液上清中VEGF变化    测得转染后24、48和72h各组细胞培养上清中VEGF的浓度，见表4，结果发现在重组质粒组24h上清中VEGF含量与对照组比较没有明显变化（F=1.9828，P=0.2182），而从48h开始含量下降，差异无统计学意义（F=4.89，P=0.0549），72h下降明显，差异有统计学意义（F=136.31，P=0.0001）。表4  各组不同时间上清中VEGF（pg/ml）的比较3  讨论    环氧合酶（cyclooxygenase COX）是花生四烯酸代谢中环氧合酶途径的限速酶，1991年被证实确实存在两种同功酶[5]：结构性COX1和诱导性COX2。前者在人体多种组织和细胞中均有表达，主要调节生理前列腺素的合成，后者在正常组织中水平很低，其表达受细胞内外许多刺激因素的影响，在病理生理反应过程中，诱导产生[6]。近年来许多研究表明，COX2在结直肠癌中高表达[7]。COX2可能通过促进血管生成，加速肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生发展过程中起了重要的作用[89]。有报道表明使用非甾体类解热镇痛药(NSAIDs)可以抑制结肠癌生长，这可能与抑制COX2有关，但是由于存在非COX2依赖的抗肿瘤作用机制，因此NSAIDs确切抗肿瘤的机制尚未完全搞清[1012]。为了进一步研究COX2基因与结肠癌的关系，以前的一些研究多采用基因敲除、反义寡核苷酸及其他COX2抑制剂等方法，由于均有一定的缺陷，结果不很满意，故在本研究中我们采用了一种新的研究基因功能的技术，即RNAi技术[13]。    RNAi技术是Fire和Mello等[1，14]在1998年研究秀丽隐杆线虫发现并且命名的，其比单独运用反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍[15]，2001年Elbashir等[16]的研究证实在哺乳动物细胞中也可以应用RNAi技术，揭开了RNAi应用于哺乳细胞研究的新篇章，《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破” [13]。在哺乳动物细胞内，由于长dsRNA可引起非特异性的基因表达抑制，所以只有1923nt的siRNA能诱导RNAi，siRNA可以高效、特异地阻断哺乳动物细胞内同源基因表达[17]，故RNAi技术非常适合用于研究和阻滞肿瘤细胞中异常基因或蛋白的表达，可能起到抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1819]。siRNA可通过化学合成、质粒或病毒载体的转录产生[20]，相比之下，质粒载体转录产生siRNA的方式更便宜，更安全，操作更简便，比较适合于长期研究肿瘤癌基因的功能，尤其是带有抗生素标记的载体可以在哺乳动物细胞中持续抑制靶基因的表达，作用可持续数星期甚至数月[2，21]。    本研究依据RNA干扰原理，按照siRNA的设计原则[34]，采用将含有真核细胞内转录启动子H1，并能分别在原核和真核细胞水平进行阳性克隆抗性筛选的真核表达载体pGPH1GFPNeo与针对COX2基因设计的siRNA相连接，构建重组子。在靶序列的选择时应用BLAST排除了与现有基因文库中所有其他人类基因同源的可能，所以具有高度的特异性。在成功地构建了重组转录载体pGPH1 GFPNeoCOX2后，通过脂质体转染导入人结肠癌HT29细胞中，荧光显微镜结果显示质粒成功导入HT29细胞内并获得成功表达，随后运用RTPCT和Western blot分别从转录水平和蛋白水平研究，发现转染重组质粒后24和48h时HT29细胞COX2表达未有明显下调，转染72h后COX2表达才明显受抑，抑制作用可以持续到转染后1周。同时发现在COX2基因被沉默72h后HT29细胞生长明显受抑制，流式细胞仪分析也证实重组转染组HT29细胞凋亡率明显增加，这进一步证明COX2表达在促进结肠癌细胞生长和抗凋亡中发挥着重要作用，通过抑制COX2表达可以抑制结肠癌细胞的生长，但COX2基因抗凋亡作用可能涉及很多途径，尚待进一步研究[12]。    本研究还发现，通过阻断HT29细胞COX2基因表达，可减少细胞合成PGE2，现已证实PGE2在肿瘤的生长、增殖以及增加侵袭性中发挥重要生物学作用[22]，抑制PGE2的产生，可以影响结肠癌细胞生长，同时PGE2合成的减少，也阻断了PGE2对COX2表达的正反馈作用[23]。另外，PGE2还可以通过EP受体/CAMP信号途径，促进肿瘤细胞产生VEGF等促肿瘤血管因子[24]，本研究中发现重组质粒转染组细胞VEGF的产生明显减少，可能与PGE2合成减少，继而阻断了这个信号途径有关，为解释NSAIDs的抗肿瘤血管作用提供了理论依据。    本研究构建的靶向性COX2 siRNA真核表达载体能够显著的抑制人结肠癌HT29细胞COX2表达，作用持续、特异而且完全，结肠癌细胞COX2基因沉默后可以抑制细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡，抑制PGE2的合成和减少VEGF的产生，这将有助于抑制肿瘤血管的形成，为进一步研究COX2与结肠癌的关系，阐明NSAIDs抗肿瘤作用，提供了新的策略和途径，可以预见靶向性的肿瘤癌基因沉默的siRNA 表达载体技术，将有望成为肿瘤基因治疗的有力工具[2526]。【参考文献】［1］ Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al. Potent and specific interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］. Nature，1998, 391(6669):806811.［2］Brummelkamp TR, Bernards R. New tools for functional mammalian cancer genetics［J］. Nat Rev Cancer，2003,3(10):781789.［3］ Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. Gene specific siRNA selector［J］. Bioinformatics，2004, 20(3):430432.［4］ Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference［J］. Nat Biotechnol，2004,22(3):326330.［5］ Appleby SB, Ristimki A, Neilson K, et al. Structure of the human cyclooxygenase2 gene［J］. Biochem J，1994，302(Pt3)：723727.［6］ Marnett LJ, DuBois RN. COX2：A Target for Cancer Prevention［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2002，42(1)：5580.［7］ Gwyn K，Sinicrope FA. Chemoprevention of colorectal cancer［J］. Am J Gastroenterol，2002，97(1)：1321.［8］ Masferrer JL，Leahy KM，Koki AT，et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase2 inhibitors［J］. Cancer Res，2000，60(5)：13061311.［9］ Folkman J. Angiogenesis and apoptosis［J］. Cancer Biology，2003，13(2)： 159167.［10］Tuynman JB,Peppelenbosch MP, Richel DJ. COX2 inhibition as tool to treat and prevent colorectal cancer［J］. Crit Rev Oncol Hematol，2004, 52(2):81101.［11］Husain SS, Imre L Szabo，Tarmawski AS，et al. NSAIDs inhibition of GI cancer growth :clinical implications and molecular mechanisms of action［J］. Am J Gastroentcrol，2002，97(3)：542553.［12］Hawk ET, Levin B.Colorectal Cancer Prevention［J］. J Clin Oncology，2005，23(2)：379391.［13］Couzin J. Breakthrough of the year.Small RNAs make big splash［J］. Science，2002，298(5602):22962297.［14］Arenz C, Schepers U. RNA interference: An ancient mechanism or a state of the art therapeutic application［J］. Naturwissenschaften，2003, 90(8):345359.［15］Aoki Y, Cioca DP, Oidaira H, et al.RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol，2003, 30(12):96102.［16］Elabashir SM, Harborth J, Lendeckel W， et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］. Nature，2001, 411(6836):494498.［17］Rozema DB，Lewis DL. siRNA delivery technologies for mammalian systems［J］. Targets，2003，2(6):253260.［18］Ryther RC, Flynt AS, Phillips JA 3rd, et al. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs［J］. Gene Ther，2005, 12(1):511.［19］Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy［J］. Cancer Gene Ther，2005,12(3):217227.［20］Amarzguioui M, Rossi JJ, Kim D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vectormediated RNAi［J］. FEBS Lett，2005, 579(26):59745881.［21］Malik I, Garrido M, Bahr M,et al. Comparison of test systems for RNA interference［J］. Biochem Biophys Res Commun，2006,341(1):245253.［22］Sheng H，Shao J，Washington MK，et al. Prostaglandin E2 increases growth and motility of colorectal carcinoma cells［J］. Biol Chem，2001，276(21)：1807518081.［23］Tjandrawnata RR，Dahlya R，HughesFulford. Induction of cyclooxygenase2 mRNA by prostaglandin E2 in human prostatic cancinoma cells［J］. British Journal of Cancer，1997，75(6)：11111118.［24］Bisacchi D，PHD，R Benelli，et al. Antiangiogenesis and angioprevention：mechanisms，problems and perspectives［J］. Cancer Detect Prev，2003，27(3)：229238.［25］Stevenson M. Therapeutic Potential of RNA Interference［J］. N Engl J Med，2004,351(17):17721777.［26］Jones SW, Souza PM, Lindsay MA. siRNA for gene silencing: a route to drug target discovery［J］. Curr Opin Pharmacol，2004,(5):522527.