黄芪总黄酮对豚鼠心室肌细胞L型钙电流及钠电流的作用

　　作者：赵明, 王洪军, 赵巍 作者单位：内蒙古民族大学附属医院，通辽 028000　吉林大学第一临床医院心脏诊疗中心，长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨黄芪总黄酮(TFA)对豚鼠心室肌细胞L型钙电流(ICaL)及钠电流(INa)的作用。方法 实验用胶原酶酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞, 利用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的ICaL及INa。结果 (1)应用TFA(20 mg·kg–1) 后ICaL从(-0.313±0.14)nA 下降到(-0.402±0.27)nA ，差异有统计学意义( P< 0.01)。(2)应用TFA(20 mg·kg 1)后与对照组比较, INa峰值从(-8.43±2.03)nA升高到(-6.37±1.58) nA，差异有统计学意义(P<0.01) 。结论 TFA可以增加豚鼠心室肌细胞ICaL的幅值， TFA可显著降低豚鼠心室肌细胞INa的幅值。

　　【关键词】 黄芪总黄酮,心室肌,L型钙电流,钠电流

　　黄芪具有显著的益气强心作用。在临床上除了用于治疗冠心病心绞痛外,还能够治疗高血压、低血压、病毒性心肌炎、肾炎、脑梗死、心律失常等[1]。现代药理研究分析，黄芪的化学成分主要有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等。黄酮的不同化学成分具有不同的药理活性。黄芪总黄酮(totalflavonoids of astragalus, TFA)是从豆科类植物黄芪中分离出来的有效活性部位，试验表明它具有清除多种自由基的功效，并且对自由基所致细胞膜蛋白质以及DNA损伤有保护作用[2] 。

　　TFA对心肌细胞电生理的作用报道较少，文献报道黄芪能够增强心脏收缩力[3]，具有抗心律失常[4]的作用，但机制不明。本研究采用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的L型钙电流(ICaL)、钠电流(INa)的方法[5，6]，观察TFA对心室肌ICaL及INa的影响，来阐明黄芪增强心脏收缩力和抗心律失常的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　TFA由内蒙古民族大学有机化学实验室提供，豚鼠(雌雄不拘，重300～350 g)由内蒙古民族大学基础医学院动物中心提供。

　　1.2 溶液配制

　　(1)有钙台氏液(mmol·L1)：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2·2H2O 1.8，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5;用NaOH 将pH 调至7.4。无钙台氏液(mmol·L1)：NaCl 143，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.25，HEPES 5;用NaOH 将pH 调至7.4。 储存液(mmol·L1)：KOH 70，Lglutamic 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2·6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1.5，用KOH 将pH 调至7.4。酶溶液：无钙台氏液+0.4 g/L collagenase+0.1 g/L protease。 (2)记录ICaL的电极内液成分(mmol·L1): Csaspartate 110, CsCl 20, ATP 2, EGTA 5,HEPES 5,用CsOH调pH值至7.3。KCl 45 Kaspartate 85, Napyruvate 5, MgATP 5, EGTA 10， HEPES 10, Glucose 11,用KOH调pH至7.3。细胞外液成分(mmol·L1): CaCl2·2H2O 5, MgCl2 1,TetraethyammoniumCl (TEACl) 135, Glucose 10, 4Aminopyridine (4AP) 5, HEPES 10,用TEAOH调pH至7.4。(3)记录INa电极内液成分(mmol·L1):CsCl 20.0, CsF 110.0, NaCl 5.0, HEPES 5.0, EGTA 5.0, MgCl2·6H2O 1.0, Na2ATP 5.0, pH 7.2, KOH调节。细胞外液成分: NaCl 5.0, CholineCl 130.0, CsCl 5.4, HEPES 10.0, MgCl2·6H2O 1.0, NaH2PO4 5.0, CaCl2 21.0, Glucoze·H2O 10, Nicardipine 0.001, pH 7.4, CsOH调节。 (4) TFA按20 mg·kg 1加蒸馏水分别制备成不同水平的溶液备用。

　　1.3 豚鼠心室肌细胞急性分离方法

　　急性处死豚鼠后，迅速开胸取出心脏，置于冰冷有钙台氏液中。行主动脉插管后固定于Langendorff 灌流架上逆向灌流心脏，有钙台氏液1.5 min，无钙台氏液6 min，酶溶液13 min，储存液3 min。灌流完毕后，沿房室沟处剪下心室部分，用眼科剪将心室肌剪成小碎块，置于盛有储存液的三角烧杯中，在37℃的水浴箱中轻轻振荡10 min，吸取上清液置于离心管中，离心5 min 后弃上清液，加入储存液，于 4℃ 的冰箱中保存备用。

　　图1 TFA对豚鼠心室肌细胞ICaL的作用(略)

　　A：对照组;B：TFA组

　　1.4 实验分组及数据的采集和处理

　　随机选取心室肌细胞，分为正常对照组、TFA(20 mg·kg1)组。在实验中，应用Pclamp 6.0 程序中的Clampex 程序记录出原始的心室肌细胞全细胞膜电流图形，再应用Pclamp 9.0 程序中的Clampfit程序对心室肌细胞ICaL、INa的全细胞膜电流作统计分析。

　　1.5 统计学处理

　　计量资料用均数±标准差(±s)表示。用SPSS11.0统计软件进行数据统计。各组之间的数值比较采用样本均数t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 TFA对豚鼠心室肌细胞ICaL的作用

　　本实验中记录了12个豚鼠心室肌细胞内向ICaL,每组为6个细胞。为记录到纯净的ICaL,实验中使用无Na+、K+离子的细胞外液,应用电极内液的高Cs+离子抑制K+电流。各组的记录均从保持电位的-50 mV阶跃至+60 mV,持续时间为300 ms。实验中所记录到的Ca2+通道的电生理学特性与文献报道一致。应用辛伐他汀10 mg·kg 1后与对照组比较, ICaL由给药前的(-0.313±0.14) nA下降到给药后的(-0.402±0.27) nA ( P<0.01，n=7)。见图1,2。

　　图2 TFA对豚鼠心室肌细胞ICaL IV曲线的影响(略)

　　2.2 TFA对豚鼠心室肌细胞INa的作用

　　采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞INa时，记录了12个豚鼠心室肌细胞ⅠNa,每组为6个细胞。电流记录均在细胞破膜后10～15 min之间进行。INa激活程序:从保持电位(EH)-80 mV,阶跃+10 mV,逐步去极化到+60 mV,刺激频率0.5 Hz,钳制时间50 ms,记录I。各电流幅值除以细胞膜电容所得即为电流密度,以不同钳制电压下的INa电流密度绘成电流电压关系(IV)曲线。结果显示，加入TFA(20 mg·kg1)与对照组比较, INa峰值从(-8.43±2.03)nA上升到(-6.37±1.56) nA，差异有统计学意义 ( P < 0.01，n=6) 。见图3,4。

　　图3 TFA对豚鼠心室肌细胞INa的影响(略)

　　A：对照组;B：TFA组

　　图4 TFA对豚鼠心室肌细胞INa IV曲线的影响(略)

　　3 讨论

　　本研究观察到TFA(20 mg·kg 1) 可增加豚鼠心室肌细胞ICaL的幅值，同时观察到TFA可显著降低豚鼠心室肌细胞INa 的幅值。这个实验结果是与TFA对豚鼠心室肌细胞动作电位的作用相符合的[6]。可能是TFA能够增强心脏收缩力和具有抗心律失常的作用。

　　本实验观察到TFA可以增加豚鼠心室肌细胞ICaL的幅值，该结果显示黄芪增加心肌收缩力的作用机制。众所周知，心肌细胞膜上的L型钙通道激活相对较快，心肌动作电位的持续时间也相对较长，因此在动作电位间期有相当数量的Ca2+ 水平迅速升高。心肌RYR对Ca2+ 较敏感，可因该间隙内 Ca2+ 水平升高而被激活，引起JSR内Ca2+的大量释放和胞质内Ca2+水平进一步升高。心肌的这种经L型钙通道内流的Ca2+触发SR释放Ca2+的机制，称为钙触发释放(calciuminduced Ca2+ release,CICR)。在心肌细胞的兴奋收缩偶联中，细胞内Ca2+水平的升高持续的很短暂，细胞内的游离Ca2+水平很快就回降至正常，因此将Ca2+水平的这种变化称为钙瞬变，钙瞬变的幅值越大，心肌细胞的收缩强度也越大[7]。本实验还显示TFA可显著降低豚鼠心室肌细胞INa 的幅值，该结果也明确解释黄芪抗心律失常的作用机制。抑制钠通道提高快反应细胞动作电位的发生阈值从而降低自律性，减慢传导，使异位起搏点自律性降低，以及消除折返激动。我们相信在未来，TFA有可能被开发成一种新型的改善血流动力学和抗心律失常的药物应用于临床。

　　【参考文献】

　　[1]周吉燕, 樊　懿 , 孔建龙，等.黄芪中不同提取成分对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的心功能影响[J]. 中国中药杂志，2000，25：301302.

　　[2]王立云.黄芪的化学成分及其药理作用[J]. 中国社区医师, 1999：10：4850.

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　　[6]张文杰,葛敬岩,赵春燕.外源性磷脂酸对心室肌细胞钙电流的作用[J].吉林大学学报　(医学版)，2006，32：422424 .

　　[7]陈 修.心血管药理学[M].人民卫生出版社，1989. 483486.