熊果酸对A549细胞增殖、凋亡的影响及其机制

【摘要】  目的 探讨三萜酸类化合物熊果酸(Ursolic Acid,UA)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 利用噻唑蓝(MTT)比色法观察UA对A549细胞增殖的影响。流式细胞仪检测UA对细胞周期的影响。用Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞核形态变化。利用免疫印迹法(Westernblot法)检测细胞中活化型Caspase3蛋白及NFκB表达的变化。结果 UA明显抑制A549细胞的生长(P<0.05)，并呈时间和浓度依赖。流式细胞仪检测发现UA作用24和48h后A549细胞阻滞在G0/G1期(P均<0.05)。经UA处理后的实验组细胞呈现典型的凋亡核固缩表现，胞核呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。胞质检测到活性Caspase3蛋白的表达增强，并呈时间依赖，同时，NFκB表达随时间延长而减弱。结论 熊果酸在体外对A549细胞具有抗增殖和诱导凋亡的作用。核因子NFκB参与肺癌细胞的增殖与凋亡调控, UA可通过抑制NFκB活性，激活Caspase3，从而诱导细胞的凋亡。

【关键词】  熊果酸 凋亡 细胞增殖 NFκB Caspase3

    0  引  言

    熊果酸(Ursolic Acid,UA)属于三萜酸类化合物，近年来研究表明，其对多种肿瘤具有广泛的抑制杀伤作用［14］。UA抗肺腺癌细胞的研究罕见报道，本研究主要探讨UA对人肺癌细胞A549抑制生长和诱导调亡的作用及机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  人肺癌细胞系  A549为本系自行传代培养，RPMI1640、PI染料、MTT、RNA酶、Hoechst33258及UA均购自Sigma公司；兔抗人Caspase3多克隆抗体、NFκB单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；二甲基亚砜、噻唑蓝为Amresco公司进口分装。

    1.1.2  主要仪器设备  流式细胞仪为Beckman公司产品，倒置光学显微镜为Olympus公司产品，荧光显微镜为Leica公司产品，半干转印仪为Biorad公司产品。

    1.2  实验方法

    1.2.1  细胞培养  A549细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2的培养箱中培养。取指数生长期细胞用于实验。

    1.2.2  增殖抑制实验  将A549细胞浓度调节至1.0×105/L,加200μl于96孔板中，24h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的干预药物),每组设6个复孔，培养一定时间后加入MTT (5g/L)20μl，继续培养4h后吸出上清，每孔加DMSO150μl，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，空白孔调零，测定各孔吸光度A值。计算增殖抑制率=[(对照组吸光度值－处理组吸光度值)/对照组吸光度值]×100％。用直线回归方程求得UA作用48h后的半数抑制浓度（IC50），此浓度为以下实验的干预浓度。

    1.2.3  细胞周期检测  取对数生长期的A549细胞2×105/ml接种于培养瓶中，培养至密度达60%～70%。实验设对照组（不加药物），UA（IC50）均重复3瓶。培养24h、 48h后常规收集细胞，PBS洗3次后，70%冷乙醇4℃固定过夜。检测前PBS洗两次,10μg/ml的RNA酶37℃消化0.5h,100μg/ml的PI避光染色30min,置流式细胞仪检测。

    1.2.4  Hoechst33258荧光染色  将A549细胞以1×105/ml浓度接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃，5%CO2培养24h后加入UA（IC50），使它的继续培养48h，弃去培养基后，用固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）固定20min。PBS漂洗2次后，加入10μg/ml的Hoechst33258， 37℃避光染色10min。荧光显微镜下观察细胞核形态。

  1.2.5  Western blot  取对照组和UA（IC50）作用24h、48h后细胞各4×106个，裂解后加等体积的上样液混匀, 煮沸3 min后进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳，用半干转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上,5％脱脂奶粉封闭。分别以Caspase3、NFκB抗体进行免疫印迹杂交(兔抗人Caspase3多克隆抗体浓度1∶100和鼠抗人NFκB单克隆抗体浓度1∶1000) 4℃下孵育过夜, 洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗 (1∶1000 稀释)，37℃孵育1h，ECL显色，压片。

    1.3  统计学处理

    用SPSS11.5软件进行单因素方差分析，半数抑制浓度（IC50）用直线相关与回归法计算。

    2  结果

    2.1  增殖抑制实验

    20～60μmol/L UA对A549具有一定增殖抑制效果，且呈较明显的浓度和时间依赖性，统计分析表明，除UA30μmol/L与40μmol/L作用A549细胞24h比较，差异无显著性（P＝0.185），UA 20μmol/L与30μmol/L作用A549细胞48h比较差异无显著性（P＝0.075）外，其余比较，见表1。经直线回归分析，得UA作用48h的半数抑制浓度IC50＝46.65μmol/L。表1  UA对A549细胞的增殖抑制效应:同一时间，与相邻低浓度作用后的抑制率比较，P＜0.05#: 同一浓度，与相邻前一作用时间的抑制率比较，P＜0.05

    2.2  细胞周期分析

    结果显示，与对照组相比，UA能引起A549细胞G0/G1期阻滞，见图1。46.65μmol/L UA作用A549细胞24h后，G0/G1期细胞由（55.5±3.1）%增加到（63.5±3.4）%(P<0.05)，作用48h后上升更为明显，为（73.0±3.5）%(P<0.05)。

    2.3  Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态改变

    46.65μmol/L UA作用A549细胞48h后，和处理，用荧光显微镜观察，可以看到细胞出现凋亡现象，凋亡细胞的细胞核固缩，染色质凝集或核片段形成凋亡小体，见图2a。对照组细胞荧光染色较浅且较均匀，未见凋亡细胞，见图2b。

    2.4  Western blot

    Western blot结果见图3。

    a: 46.65μmol/L UA处理A549细胞对照、24、48h后，随时间延长NFκB的表达减低；b: 46.65μmol/L UA处理A549细胞对照、24、48h后，活化型Caspase3随时间延长表达增加

    3  讨论

    本实验证明UA对A549细胞具有增殖抑制和杀伤效应，这一效应可能通过直接杀伤和诱导凋亡来实现。UA主要阻断细胞于G0/G1期，反映了细胞的自身保护机制，使细胞有足够的时间修复受损DNA。若修复成功，细胞便可进入分裂增殖阶段，反之细胞则进入凋亡阶段，其凋亡机制可能是通过抑制NFκB活性，激活Caspase3,最终诱导细胞的凋亡。

    NFκB是有Rel蛋白家族的成员以同源或异源二聚体的形式组成的一组转录因子。其中p65/p50异源二聚体是NFκB的典型代表，p50含核定位信号,与DNA直接结合，p65含转录活化区域，参与基因转录的起始凋节，具有转录激活功能。静息状态下，NFκB蛋白二聚体与特异性抑制蛋白IκB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞质中。当细胞受到细胞因子、致凋亡因子、与细胞分裂增殖有关的因素等外来刺激时，NFκB可被活化，活化的NFκB进入胞核与细胞核内某些基因启动子中的特异性序列结合后启动或者调节下游基因的转录。

    在细胞凋亡信号通路的分子中，Caspase家族具有重要地位,它通过下游效应因子切断细胞间的信号传递，最终诱导凋亡小体来执行凋亡功能[5]。在正常活细胞中，Caspase3以前体酶原(32kd)形式存在于胞质中，在死亡信号的诱导下，由激活的起始Caspase水解效应Caspase酶原使Caspase3前体被快速活化为Caspase3，本实验中我们观察到UA作用24h和48h后Caspase3被水解为17KDa的活性片段，说明在UA对A549作用过程中有Caspase3的活化，证明Caspase级联反应被触发，从而使细胞进入凋亡阶段。

  Achiwa等[6]研究表明熊果酸能诱导子宫内膜癌细胞SNGII的凋亡，并发现活化Caspase3的表达呈时间和剂量依赖。Shishodia等[7]研究证实熊果酸能抑制多种致癌因子引起的NFκB活性的增高，并能阻止IκB的降解，IκB和p65的磷酸化，p65的核移位，以及NFκB依赖受体基因的表达。Wang等[8]研究证实，NFκB可直接上调凋亡抑制因子（cIAP1、cIAP2）和TNF受体相关因子（TRAF1和TRAF2）等，这些抗凋亡因子可抑制蛋白酶始动因子Caspase8的活性。我们的研究从反面印证了在熊果酸作用下，NFκB的活性被抑制，Caspase3活性亚单位表达增加，细胞最终走向凋亡。

    由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程，详细机制仍在研究中。NFκB与Caspase3之间具体的信号传导途径需要更进一步研究。目前所知，多种抗癌药疗效差的原因之一，是在杀伤肿瘤细胞的同时，活化了NFκB，故而抑制NFκB活性可以增强肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性。是否可以利用熊果酸对NFκB活性的抑制作用，联合其他化疗药物，增强其他化疗药物的疗效，也值得我们进一步探讨。

【参考文献】  ［1］ Achiwa Y, Hasegawa K,Udagawa Y,et al. Molecular mechanism of ursolic acid induced apoptosis in poorly differentiated endometrial cancer HEC108 cells[J]. Oncol Rep,2005,14(2):507512.

[2] Kim DK, Baek JH, Kang CM, et al. Apoptotic activity of ursolic acid may correlate with the inhibition of initiation of DNA replication[J]. Int J Cancer, 2000,87(5):629636.

[3] Andersson D, Liu JJ, Nilsson A, et al. Ursolic acid inhibits proliferation and stimulates apoptosis in HT29 cells following activation of alkaline sphingomyelinase[J]. Anticancer Res, 2003, 23(4):33173322.

[4] Hollosy F, Idei M, Csorba G, et al.Activation of caspase3 protease during the process of ursolic acid and its derivativeinduced apoptosis[J]. Anticancer Res, 2001,21(5):34853491.

[5] Nicholson DW, Thorberry NA. Caspase : killer protease[J] . Thernds Bichem Sci,1997,22(8):299306.

[6] Achiwa Y, Hasegawa K, Komiya T,et al. Ursolic acid induces Baxdependent apoptosis through the caspase3 pathway in endometrial cancer SNGII cells[J]. Oncol Rep, 2005,13(1):5157.

[7] Shishodia S, Majumdar S, Banerjee S, et al. Ursolic acid inhibits nuclear factorkappaB activation induced by carcinogenic agents through suppression of IkappaB alpha kinase and p65 phosphorylation: correlation with downregulation of cyclooxygenase 2, matrix metalloproteinase 9, and cyclin D1[J]. Cancer Res, 2003,63(15):43754383.

[8] Wang CY, Mayo MW, Korneluk RG, et al. NFkappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and cIAP1 and cIAP2 to suppress caspase8 activation[J]. Science,1998,281(5383):16801683.