核因子κB在胰腺癌中的表达及与VEGF和p53表达的相关性

【摘要】  目的 探讨核因子κB (NFκB,p65)在胰腺癌组织中的表达及其与VEGF、p53蛋白表达的相互关系。方法 电泳迁移率变动分析 (EMSA)测定45例胰腺癌及癌旁组织、8例慢性胰腺炎和9例正常胰腺组织中NFκB的活性,Western印迹法检测NFκB、IκB a蛋白表达; 免疫组织化学法检测胰腺癌中VEGF、p53、p65蛋白表达。结果 NFκB在肿瘤组织中被激活；NFκB在胰腺癌、旁组织、慢性胰腺炎、正常胰腺组织中阳性表达率分别为71.0%、20.0%、12.5%、0(P<0.05)；NFκB基因表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关(P>0.05)，与淋巴结转移和周围浸润有相关性(P<0.05)；转移癌中NFκB蛋白表达与VEGF、p53蛋白表达显著相关。结论 核因子κB基因在胰腺癌中过度表达并与VEGF、p53一起参与胰腺癌的浸润、转移过程。

【关键词】  胰腺癌 核因子κB 抑制性κBa 血管内皮生长因子 蛋白质p53

   0  引  言

    最近研究发现，肿瘤细胞浸润转移能力的改变是通过核因子κB对其他因子的调节作用实现的，但具体的作用机制还不清楚。本文拟研究核因子κB在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌生物行为的关系以及核因子κB表达与VEGF、p53表达的相关性，为肿瘤的基因治疗提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    收集苏州大学第一附属医院普通外科2000年4月～2005年5月期间病理诊断均为导管腺癌的45例胰腺癌石蜡标本（临床资料完整）及其45例癌旁组织 (距癌灶边缘1.5～2.0cm， 33例呈Ⅰ/Ⅱ级不典型增生表现，4例呈原位癌改变，5例有炎性变化，3例有癌细胞浸润)。其中男25例，女20例，年龄36～70岁，中位数55岁；肿瘤直径＜4cm者21例，≥4cm者24例；高分化13例,中分化14例,低分化18例；根据TNM分期（1997 恶性肿瘤国际临床病期分类）标准：Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期13例、Ⅳ期12例；伴有区域或远处淋巴结转移和周围浸润者30例，其中远处转移者18例（肝转移、腹膜和网膜种植等）无淋巴结转移和周围浸润者15例。8例慢性胰腺炎和9例正常胰腺组织新鲜标本，取自壶腹癌和胰腺内分泌肿瘤的病人。所有标本在术后立即放入-70℃冰箱备用，所有病人均为第一次手术,术前未经任何放化疗。

    1.2  主要试剂

    鼠抗人p65单抗、鼠抗人IκBa多抗、鼠抗人p53单抗（突变型）、鼠抗人VEGF单抗，免疫组化染色（SP）试剂盒均购自北京中山生物技术公司， γ32ATP标记的双链寡核苷酸探针：

    5、AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3

    3、TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5

    1.3  方法

    1.3.1  Westernblot分析  提取细胞核蛋白 [1]，采用Lowry法准确测定浓度。蛋白质样品上样量每泳道为100μg，用10%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到Hybond硝酸纤维素膜上（美国Bio Rad公司）。

    1.3.2  电泳迁移率变动分析  细胞核的制备、核提取液蛋白含量的测定和反应条件参考文献[1]。

    1.3.3  免疫组化  操作方法按照试剂盒进行， p53、VEGF、p65表达的判断按照文献方法［2,3］。

    1.3.4  统计学方法  采用医学统计软件SPSS10.0,χ2检验, Spearman相关分析。

    2  结果

    2.1  Western 检测NFκB、IκBa的表达  p65在肿瘤组织的灰度值高于癌旁组织，IκBa在肿瘤组织的灰度值低于癌旁组织，（正常胰腺和慢性胰腺炎组织偶见表达），说明肿瘤组织中p65激活，而IκBa失活见图1、表1。

  1：肿瘤组织；2：肿瘤旁组织；3：正常胰腺组织；4：慢性胰腺炎组织

    图1  Western印迹分析p65、IκBa的表达

    2.2  EMSA检测NFκB的活性

    胰腺癌组织中可见明显的条带,癌旁组织少量条带，慢性胰腺炎和正常胰腺组织未见条带，提示肿瘤组织NFκB结合活性提高，见图2。

    2.3  免疫组化法检测VEGF、p53、p65蛋白表达  p65在肿瘤组织的检出率71%(32/45),高于癌旁组织20%(9/45），P<0.01；p53、VEGF 在胰腺癌组织中的阳性表达分别为57.8%（26/45）、64.4%（29/45），分别高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），VEGF阳性染色位于细胞质，阳性细胞分布在血管周围，见图3。

    1：正常胰腺组织；2：慢性胰腺炎组织；3：肿瘤旁组织；4：肿瘤组织

    图2  NFκB在不同组织中的活性检测

    2.4  胰腺癌的临床病理特征与p65蛋白表达的关系  p65蛋白表达与胰腺癌的分化程度、临床分期，肿瘤大小无关(P>0.05)；但p65蛋白在浸润转移组的表达率高于非浸润转移组（P<0.01），远处转移组高于非远处转移组（P<0.05），见表1。表1  胰腺癌的临床病理特征与p65蛋白表达

    2.5  胰腺癌组织p65蛋白表达与VEGF、p53蛋白表达的相关性分析  VEGF在浸润转移组和远处淋巴结转移组的阳性表达率分别为70%（21/30）和88.9%(16/18); p53在浸润转移组和远处转移组的阳性表达率分别为66.7%（20/30）和83.33%(15/18)。在浸润转移和远处淋巴结转移组中的VEGF阳性表达组中，VEGF和p53的阳性表达符合率为61.9%（13/21）和75.0%（12/16）。30例浸润和淋巴结转移组胰腺癌组织中，p65阳性表达27例，VEGF在这27例中阳性表达19例，两者符合率为70.4%（19/27）。但在17例p65阳性表达的远处转移组中，VEGF阳性表达14例，两者符合率为82.4%（14/17）。同样，在转移组和远处转移组中，p53和p65的表达符合率分别为59.3%（16/27）和82.4%（14/17）。

    3  讨论

    核因子κB（NFκB、p50/p65）是近年来发现的一种转录因子，其表达水平与某些肿瘤的浸润、粘附、转移行为密切相关。近年来发现，核因子κB引起肿瘤细胞浸润、粘附、转移的原因是由于核因子κB激活后导致许多粘附分子、血管生长因子、基质蛋白酶的瀑布样释放。我们发现 [4,5]，核因子κB在肝癌中高表达，并且表达越高，转移率越高；细胞系研究揭示[6]，核因子κB与肝癌转移的关系通过MMP9实现；前列腺癌和膀胱癌的研究中发现[7,8]，核因子κB与肿瘤转移的关系分别通过MMP9 、VEGF和 IL8实现；胰腺癌细胞系研究提示[9]，核因子κB与胰腺癌细胞转移行为有关，VEGF、IL8参与了这个过程。

    本研究发现，胰腺癌组织中NFKB被活化， p65蛋白在癌组织表达明显增高，表明NFκB激活在胰腺癌的发生发展中有重要作用。本研究还发现，p65蛋白表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关，但与与肿瘤周围浸润和淋巴结转移有关：p65蛋白表达在浸润和淋巴结转移组高于非浸润和转移组，远处转移组高于非远处转移组，说明核因子κB参与了胰腺癌的浸润转移过程。

    VEGF是最重要的促进血管生成的因子。有研究发现[10,11]，胰腺癌细胞VEGF基因的表达受NFκB基因调控，因为NFκB激活或阻滞后，VEGF表达和血管生成发生变化，肿瘤细胞的转移能力发生改变，肺癌细胞系的研究也得到了相同的结果[12]。在本试验中，VEGF在胰腺癌组织中高表达，且VEGF表达水平与胰腺癌淋巴结转移和远处转移有关，VEGF基因表达的改变可能与上述机理有关。

 VEGF受多种因素调节，近年来研究表明，野生型p53下调VEGF表达，而突变型失去这种功能[13]，本研究中突变型p53蛋白在胰腺癌中高表达(57.8%)，且p53、VEGF有很高的阳性表达符合率，突变型p53蛋白可能参与VEGF表达的调控，从而间接参与胰腺癌血管生成。

    NFκB和野生型p53基因表达是相互协调的[14]。在肿瘤组织中突变型p53废除了野生型p53的作用，当NFκB激活后，野生型p53诱导细胞凋亡的作用丧失，对NFκB的抑制作用丧失。在本研究中，NFκB表达增加可能与p53突变和野生型p53抑制作用下降有关。

    比较NFκB、p53、VEGF表达的相关性发现，在转移组或远处转移组中，NFκB表达与p53、VEGF表达的符合率在80%左右，表明NFκB、p53、VEGF表达是相互联系的，它们在胰腺癌的浸润转移过程中共同发挥了作用，因此 NFκB是胰腺癌基因治疗的靶点。

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