阻断氯通道对人喉癌Hep2细胞增殖及其RNA编辑酶1表达的影响

阻断氯通道对人喉癌Hep2细胞增殖及其RNA编辑酶1表达的影响作者：余文发，赵玉林，董明敏    作者单位：450052 郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科    【摘要】  目的 研究氯离子通道阻断剂5硝基2(3苯丙氨基)苯甲酸(NPPB)对人喉癌细胞系Hep2细胞增殖及其RNA编辑酶1（RNAdependent adenosine deaminase 1，ADAR1）表达的影响。方法 以Hep2细胞为研究对象，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测NPPB对Hep2细胞增殖的影响；用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测氯通道阻断前后Hep2细胞ADAR1 mRNA表达的变化。结果 NPPB浓度依赖性地抑制Hep2细胞增殖，NPPB阻断Hep2氯通道前后ADAR1 mRNA表达量存在显著性差异。结论 阻断Hep2细胞氯通道，可抑制Hep2细胞增殖；Hep2细胞RNA编辑酶1的表达可能和氯通道密切相关。    【关键词】  喉肿瘤；氯通道；RNA编辑酶1；逆转录聚合酶链反应    Effects of Blocking Chloride Channel on Proliferation and Expression of RNAdependent Adenosine Deaminase 1 for Human Larynx Cancer Hep2 Cell  YU Wenfa,ZHAO Yulin, DONG Mingmin  Department of Otolaryngology,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052， China    Corresponding Author: ZHAO Yulin，Email: zhaoyulimail@163.comAbstract：Objective   To study the effects of blocking chloride channel on the proliferation and RNAdependent adenosine deaminase1（ADAR1）for  human larynx cancer Hep2 cell lines.Methods  Hep2 cell was used as a target. The effects of chloride channel blocker(NPPB) on the proliferation of Hep2 cell were evaluated by means of MTT assay. Semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) was performed to measure the expression of ADAR1 mRNA in selected Hep2 cell clones.Results  Controlling the proliferation of Hep2 depended on the consistency of chloride channel blocker(NPPB).The relative intensities of ADAR1 mRNA of  Hep2 was remarkably different before and after its chloride channel was blocked.Conclusion  Our results suggest that blocking the chloride channel could restrain the proliferation of Hep2.Normal expression and functioning of chloride channel is essential for the maintenance of proper cell growth.There is close correlation between the chloride channel and ADAR1 mRNA of Hep2.    Key words：Llarynx tumor；Chloride channel；RNAdependent adenosine deaminase1（ADAR1）；Rreverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR).    喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康，至今其发生发展机制未完全明了。氯离子是机体含量最多的、最富有重要生理意义的阴离子，近年研究表明，氯通道与肿瘤细胞增殖有关[12]；同时RNA编辑酶1（RNAdependent adenosine deaminase 1，ADAR1）在从原虫到哺乳动物的体内广泛存在[34]，研究表明ADAR1亦与肿瘤的形成密切相关[56]，目前国内外尚未见关于喉癌细胞膜离子通道特性及ADAR1表达情况的研究报道，本试验以MTT比色法检测NPPB阻断氯通道对Hep2细胞增殖的影响，应用半定量RTPCR检测阻断氯通道前后Hep2 细胞ADAR1 mRNA的变化。1  材料与方法    1.1  材料    人喉癌Hep2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，5硝基2(3苯丙氨基)苯甲酸[5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB]、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)均购自美国Sigma公司；RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。NPPB溶于DMSO中配成浓度为0.2 mol/L的储存液，20℃避光保存备用。ADAR1引物序列由上海生物工程有限公司合成。    1.2  方法    1.2.1  细胞培养  Hep2在5%CO2、孵箱37℃下开放式培养，培养液RPMI1640含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，细胞密度为(0.1～1)×l06/ml，3～5 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验，见图1。    1.2.2  MTT比色法检测NPPB对Hep2细胞增殖的影响  将Hep2以2×105/ml密度接种于96孔培养板中，每孔190 μl，培养12 h待细胞完全贴壁后弃去培养液后加入NPPB，使之终浓度分别为0 μmol/L(对照组)、10、50、75、100、200 μmol/L(DMSO浓度为0.1%)，每一浓度重复6孔，阻断1 h后冲洗，冲洗后的Hep2再培养48 h，每孔加入MTT 20 μl，继续培养4 h，吸弃培养液，用无血清培养液漂洗1次，加入MTT裂解液100 μl，孵箱中孵育8 h后，微量振荡器振荡5 min待紫色结晶完全溶解后，用酶标测试仪测定每孔光密度值，细胞增殖抑制率=(1实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。    1.2.3  RTPCR检测Hep2 细胞ADAR1 mRNA的表达     1.2.3.1  阻断Hep2细胞氯通道前ADAR1 mRNA的表达    采用Trizol(Invitrogen)一步法提取总RNA。紫外分光光度仪测定RNA的质量与数量，并将所有标本的RNA浓度稀释至400～500 μl/ml。按MMuLV逆转录酶试剂盒(Fermentas)说明取2 μg总RNA经反转录酶SuperscriptⅡ反转录合成cDNA。    取1 μl cDNA作为PCR反应的模板，PCR扩增设立胎盘组织阳性对照、空白模板阴性对照反应体系。在DEPCH2O 35 μl依次加入10×PCR Buffer 5 μl MgCl2 3 μl、10 mmol/L dNTP混合物2 μl、cDNA2 μl、正反义引物各1 μl、TaqDNA聚合酶1 U，总体积50 μl。ADAR1反应条件为：94℃预变性5 min、94℃ 45 s、56℃ 55 s、72℃ 90 s，共27个循环。以DL2000 DNA  Marker(Takara)为参照。    取PCR产物5 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，UVP凝胶成像系统及Labworks软件进行检测和光量子强度分析，将阳性条带的密度与βactin条带密度的比值作为ADAR1 mRNA的相对表达量。    回收凝胶PCR产物，pMD18T载体连接，转化感受态XL10并扩增，提取质粒经EcoRⅠ、SalⅠ(Takara)酶切鉴定，测序及BLAST比对正确。    1.2.3.2  氯通道阻断后Hep2 的ADAR1 mRNA表达    给予200 μmol/L NPPB阻断Hep2氯通道分别30 min、1 h、2 h后冲洗,应用1.2.3.1同样方法分别检测Hep2 的ADAR1 mRNA表达，比较同一浓度氯通道阻断剂阻断不同时间前后ADAR1 mRNA的相对表达量的改变。    分别给予氯通道阻断剂NPPB 10、50、75、100、200 μmol/L，阻断Hep2氯通道1h后冲洗，应用1.2.3.1同样方法检测Hep2 的ADAR1 mRNA表达，比较不同浓度氯通道阻断剂阻断前后ADAR1 mRNA的相对表达量的改变。    1.3  统计学方法    计量资料以±s表示，用t检验或方差分析进行显著性分析，对两组数据的相关性采用直线回归的方法对相关系数进行检验，α=0.05为检验水准。2  结果    2.1  氯通道阻滞剂NPPB在Hep2细胞增殖中的作用    5个不同浓度的NPPB阻断Hep2细胞氯通道1 h后冲洗，再培养48 h后，进行MTT比色，结果行单因素方差分析（F=99.03），表明各组均数不全相等，进一步用Dunnettt检验发现：10、50 μmol/L的NPPB对Hep2细胞增殖的影响，差异无统计学意义(P1=0.83、P2=0.76)；而75 μmol/L的NPPB对Hep2细胞增殖有明显抑制作用，细胞增殖抑制率为29.76%，差异有统计学意义(P=0.013)；随着浓度的增加，抑制作用增强，100、200 μmol/L NPPB对Hep2细胞增殖分别抑制48.57%、64.12%，差异有统计学意义(P均＜0.000)，氯通道阻滞剂NPPB浓度依赖性地抑制了Hep2细胞增殖。    2.2  一定浓度NPPB阻断氯通道不同时间对ADAR1 mRNA表达的影响    NPPB阻断氯通道前Hep2细胞ADAR1 mRNA均有表达，相对表达量为2.852±0.769，见图2；给予200 μmol/L NPPB阻断Hep2氯通道30 min、1 h、2 h后Hep2 细胞ADAR1 mRNA相对表达量分别为1.463±0.672、0.785±0.261、0.692±0.165。将阻断氯通道前和阻断后各组结果进行成组t检验，阻断不同时间前后均存在显著性差异(30 min：t=7.62, P<0.05；1 h：t=14.82, P<0.001；2 h：t=16.92, P<0.001)，见图3。将200 μmol/L NPPB阻断氯通道30 min后与阻断1、2 h后Hep2 细胞ADAR1 mRNA相对表达量分别比较差异有统计学意义（t=8.52, P<0.05；t=9.52, P<0.05）；比较阻断氯通道1 h后和2 h后Hep2 细胞ADAR1 mRNA相对表达量差异无统计学意义（t=0.58, P＞0.10）。    2.3  不同浓度NPPB阻断氯通道相同时间对ADAR1 mRNA表达的影响    分别给予氯通道阻断剂NPPB 10、50、75、100、200 μmol/L，阻断Hep2 细胞氯通道1h后Hep2 细胞ADAR1 mRNA相对表达量分别为1.463±0.672、1.256±0.125、1.052±0.156、0.875±0.856、0.693±0.452。ADAR1 mRNA相对表达量组间比较差异均有统计学意义(10 mmol/L与50 mmol/L组比较t=9.53, P<0.05；50 mmol/L与75 mmol/L组比较：t=10.25, P<0.05；75 mmol/L与100 mmol/L组比较：t=9.95, P<0.05；100 mmol/L与200 mmol/L组比较：t=8.35, P<0.05)。3  讨论    氯离子是生物体内最多的阴离子，氯离子通道广泛分布于哺乳动物的组织器官和各种细胞中，在维持静息膜电位，调节细胞内钙、pH值，影响细胞增生和分化中起着重要的作用。研究表明[7]氯通道和细胞增殖及凋亡密切相关，阻断氯通道影响低分化鼻咽癌（CNE2Z）细胞增殖及凋亡，同时氯通道阻断剂对凋亡诱导剂诱导的细胞凋亡有一定的保护作用[8]。    本实验以人喉癌细胞系Hep2细胞为研究对象、利用MTT比色法进行研究，结果发现氯通道阻滞剂NPPB抑制了人喉癌Hep2细胞增殖，而且NPPB的这种作用呈浓度依赖性, 提示在细胞增殖过程中可能有氯通道的激活，氯通道在Hep2细胞增殖过程中有重要作用。氯通道阻滞剂NPPB通过何种机制抑制了人喉癌Hep2细胞增殖的呢？为进一步研究这个问题，本实验对氯通道阻断前后的另一指标进行了研究，这一指标就是ADAR1 mRNA。    RNA编辑是转录后mRNA和tRNA碱基变化的现象，是一种对基因编码的mRNA进行重新修饰的过程，如RNA编辑改变可使得RNA所携带的遗传信息发生改变，导致最终的蛋白序列、结构和功能的改变，研究表明RNA编辑的错误与肿瘤的发生紧密相关。对RNA发生编辑作用的酶称为RNA编辑酶, 在从原虫到哺乳动物的体内广泛存在[34]。它以脱氨的方式将前体mRNA中某一特异位点的腺嘌呤(Adenosine，A)变为次黄嘌呤(Inosine，I)，即A变为I；或者是胞嘧啶(Cytosine)变为尿嘧啶(Uracil)，即C变为U。Maas S等[9]发现在人类神经胶质瘤组织中存在着大量未经编辑的RNA，经过编辑的特异性RNA通常编码调节离子向胞内流动的通道蛋白，而未经RNA编辑的蛋白会改变离子通道的性质，从而影响脑细胞之间的正常通讯。RNA编辑的缺陷会造成胞内外离子浓度的失衡，进一步造成细胞损伤和肿瘤样生长异常。因此参与这种信号途径的每一个蛋白的变化都可能引起肿瘤的发生与增殖。Wang等[5]研究发现，人宫颈癌传代细胞的增殖生长与ADAR1的异常表达有显著相关性。    喉癌的发病和复发转移机制复杂其发生、恶性转归和浸润性生长涉及到复杂的细胞学变化,这些变化与细胞生长增殖的各种信号途径密切相关。在这些过程中,存在着大量的转录、翻译及反转录，这些过程中氯通道有何意义呢？本结果表明一定浓度的NPPB阻断氯通道不同时间前人喉癌细胞系Hep2细胞ADAR1 mRNA的相对表达量明显高于阻断后。阻断氯通道时间相同时，NPPB浓度越高，阻断氯通道前后ADAR1 mRNA的相对表达量相差越大，且阻断前ADAR1 mRNA的相对表达量明显高于阻断后。    综上所述，本试验结果表明人喉癌细胞系Hep2细胞增殖与氯通道有密切相关性，氯通道影响Hep2细胞增殖，可能与Hep2细胞ADAR1 mRNA的表达有关。【参考文献】［1］ Chen LX, Zhu LY, Jacob TJ, et al.Roles of volumeactivated Clcurrents and regulatory volume decr ease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Cell Prolif, 2007,40(2):253267.[2] Le Guennec JY, OuadidAhidouch H, Soriani O, et al.Voltagegated ion channels, new targets in anticancer research[J].Recent Patents Anticancer Drug Discovery, 2007,2(3):189202.[3] Reenan RA.Molecular determinants and guided evolution 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