KiSS 1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达

KiSS 1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达作者：徐玫芳， 臧盛兵， 黄爱民， 刘景丰， 高凌云， 高美钦    作者单位：福建医科大学1.基础医学院 病理学系，肿瘤研究室，福州 350004;2.附属第一医院 肝病中心，福州 350005     【摘要】  目的 构建KiSS1基因重组真核质粒，将其导入人高转移肝癌MHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为进一步研究KiSS1基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响奠定基础。 方法 Trizol试剂法提取新鲜胎盘组织总RNA，经RTPCR扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体，采用脂质体介导转染技术将高纯度的KiSS1质粒转染到人高转移肝癌细胞株中，用RTPCR和Western blot技术加以鉴定。 结果 RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段，经PCR、双酶切鉴定及测序，证实已将KiSS1基因cDNA片段正确插入真核表达载体中;RTPCR、免疫细胞化学和Western blot证实KiSS1基因已转染入MHCC97H细胞中。 结论 成功获得pcDNA3.1/HisC/KiSS1重组质粒和瞬时表达KiSS1基因的肝癌细胞，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础，为体内外实验研究KiSS1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。    【关键词】  肿瘤抑制蛋白类 遗传载体 转染 肝肿瘤 肿瘤侵润 真核细胞核 质粒　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，居男性恶性肿瘤第3位，病死率高，为恶性肿瘤的第二死因[1]。HCC易发生早期侵袭转移，是患者术后高复发乃至死亡的主要原因。KiSS1作为一个肿瘤转移抑制基因，在很多肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用[23]，但在与肝癌关系的研究中，国内外部分学者发现其与肿瘤转移抑制作用存在相悖[45]。因此深入研究KiSS1基因的表达与HCC侵袭、转移及预后的关系很有必要。为此，笔者利用基因克隆技术构建了真核表达载体pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并将其导入人高转移HCC MHCC97H细胞中，获得瞬时表达的细胞株，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS1对人HCC细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。1 材料与方法　　1.1 材料 新鲜胎盘组织来源于福建医科大学附属第一医院妇产科正常分娩的胎盘;大肠杆菌Ecoli.Dh5α、真核表达载体pcDNA3.1/HisC由福建医科大学分子医学生物中心惠赠;Trizol试剂及脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品;RTPCR逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶(Xho I, BamH I)、T4 DNA连接酶为美国Fermentas公司产品;质粒大量抽提试剂盒为北京Tiangen公司产品;兔抗人KiSS1为美国Santacruz公司产品;Elivision plus二抗试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品;细胞裂解液为美国Pierce公司产品;PCR引物：根据Gene Bank中查到的KiSS1的mRNA序列，用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(划线部分分别是BamH I和Xho I的碱基识别序列，斜体部分为保护序列)：　　上游：5′CCAGGATCCATGAACTCACTGGTTTCTTGG3′　　下游：5′AGACTCGAGTCACTGCCCCGCACCTG3′　　1.2 方法　　1.2.1 重组真核质粒的构建与鉴定　　1.2.1.1 RTPCR扩增目的片段KiSS1基因 取50 mg冷冻的新鲜胎盘组织Trizol试剂法提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性;所得RNA用Fermentas逆转录试剂盒将其逆转为cDNA，并将其通过PCR法进行扩增，产物行凝胶电泳，目的片段按胶回收试剂盒说明书行胶回收纯化，-20 ℃保存。　　1.2.1.2 KiSS1和真核表达载体pcDNA3.1/HisC的酶切与连接 0.2 mL离心管中依次加入BamH I 1 μL、Xho I 2 μL、Buffer BamH I 2 μL及KiSS1 DNA 15 μL，37 ℃水浴过夜，加入6×上样缓冲夜4 μL进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切的产物胶回收。BamH I、Xho I双酶切质粒pcDNA3.1/HisC，步骤同上。将上述回收产物加入如下反应体系：10×连接缓冲液2 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切KiSS1 9 μL，双酶切pcDNA3.1/HisC 8 μL，终体积20 μL，4 ℃连接过夜。取上述连接产物10 μL转化至150 μL感受态大肠杆菌Ecoli.Dh5α中，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上37 ℃培养16～20 h，形成单菌落。随机挑选2～3个菌落分别接种于LB液体培养基2 mL中(含氨苄青霉素2 μL)，37 ℃摇床250 r/min振荡过夜。　　1.2.1.3 阳性重组子的鉴定 (1)PCR鉴定重组质粒。取1 μL上述振摇扩增过夜的菌液，PCR法进行扩增，产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(2)双酶切鉴定重组质粒。将PCR鉴定阳性的克隆进行摇菌扩增，按质粒抽提试剂盒说明书抽提质粒。质粒进行BamH I、Xho I双酶切鉴定，步骤同KiSS1双酶切，产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)目的片段的测序鉴定。如经上述鉴定均证实目的片段已连入载体中，则取阳性克隆菌液100 μL，交上海生工生物工程公司测序鉴定。　　1.2.2 脂质体介导的细胞转染 转染前1 d将处于对数生长期的MHCC97H细胞以每孔3×105的密度接种于6孔培养板。转染当天，细胞达60%～80%融合。将重组pcDNA3.1/HisC/KiSS1和pcDNA3.1/HisC质粒转染入人HCC细胞，分别命名为转染组(MHC/KiSS1)和空载体组(MHC/pcDNA3.1);未转染的MHCC97H细胞命名为未转染组。未转染组和空载体组分别设为空白对照组和阴性对照组。采用脂质体Lipofectamine 2000介导基因转染，据说明书操作。转染6 h后更换含15%胎牛血清的生长培养基，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中继续培养至转染后48 h。　　1.2.3 转染结果的鉴定　　1.2.3.1 RTPCR法检测mRNA Trizol法分别对3组细胞进行总RNA抽提，获得符合逆转录要求的RNA;Fermentas二步法进行RTPCR反应(方法如前述)，产物于-20 ℃保存。　　1.2.3.2 免疫细胞化学法检测KiSS1蛋白的表达 常规细胞爬片，脂质体介导细胞转染。转染后48 h，取出爬上细胞的盖波片，PBS冲洗2次，95%乙醇固定20 min，蒸馏水冲去残留乙醇，采用Elivision plus二步法，据试剂说明书操作，一抗KiSS1工作浓度为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素复染。　　1.2.3.3 Western blot检测KiSS1蛋白表达 3组细胞经细胞裂解液裂解提取总蛋白。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。各组样本分别取总蛋白300 μg,经16.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后半干式转PVDF膜，室温封闭5 h。与特异性的一抗4 ℃孵育过夜，与二抗(辣根过氧化物酶标记)室温孵育2 h后，化学发光法显影，以βactin作为内参照，观察3组细胞的KiSS1蛋白表达情况。2 结 果　　2.1 胎盘组织总RNA完整性鉴定及纯度和浓度测定 提取的胎盘组织总RNA进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果显示清晰的28 S和18 S两条RNA带，说明提取的总RNA的完整性良好。对RNA样品进行紫外分光光度分析，显示提取的RNA无蛋白质和DNA污染(D260/D280为1.85)，浓度(2 091.9 ng/μL)符合逆转录的要求。　　2.2 从胎盘组织扩增出的KiSS1基因进行凝胶电泳 PCR扩增出目的片段(包含酶切位点和保护碱基)，琼脂糖凝胶电泳显示约456 bp的DNA片段，片段的大小与预期结果一致(图1)。　　2.3 重组质粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1的PCR和双酶切鉴定 经PCR鉴定，扩增出约438 bp的目的片段，片段的大小与预期结果相符，初步表明目的片段连接上重组载体;经双酶切鉴定，产生重组质粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1中约5.5 kb的空载体和插入的约438 bp的目的DNA，进一步证实了重组体大小与预期结果一致，成功获得了重组真核表达载体pcDNA3.1/HisC/KiSS1(图2)。　　2.4 重组质粒pcDNA3.1/HisC/KiSS1的测序鉴定 经上海生工生物工程公司的序列测定分析，KiSS1的序列与Gene Bank中KiSS1 cDNA的序列完全一致(图3)。 1：marker;2：目的质粒KiSS1 PCR;3：目的质粒酶切;4：目的质粒;5：空质粒酶切;6：空质粒.　　2.5 RTPCR法检测细胞的mRNA水平 转染后48 h，RTPCR法检测KiSS1 mRNA在3组细胞中的表达情况，电泳结果显示，3个泳道GAPDH mRNA条带的亮度相似，而KiSS1 mRNA条带只有转染组细胞出现，未转染组细胞和空载体组细胞均未出现，说明转染组MHC/KiSS1细胞mRNA水平上有表达KiSS1基因(图4)。　　2.6 免疫细胞化学法检测KiSS1在细胞中的表达 爬片细胞的免疫细胞化学染色结果显示，未转染MHCC97H细胞和MHC/pcDNA3.1细胞中未见KiSS1阳性信号，而在实验组MHC/KiSS1细胞中KiSS1呈阳性表达，阳性产物定位于细胞质中，表明转染后48 h，转染组MHC/KiSS1细胞高效表达KiSS1蛋白(图5)。　　2.7 Western blot检测KiSS1在细胞中的表达 3组细胞均可检测到分子量约43 kD的内参蛋白βactin的表达，但只有转染组细胞中有相对分子量15.4 kD的KiSS1蛋白的表达，而未转染组细胞和空载体组细胞中未检测到此蛋白。上述结果表明，转染48 h后，转染组MHC/KiSS1细胞高效表达KiSS1蛋白(图6)。3 讨 论　　尽管通过外科手术切除、肝动脉栓塞、放射治疗和全身化疗等治疗措施，HCC得到一定程度的遏制，但肿瘤的侵袭和转移仍长期困扰患者，成为术后高复发及致死的主要原因。KiSS1是目前公认的为数不多的肿瘤转移抑制基因之一，1990年代由Lee和Welch等首次报道的[6]。后续研究证明，KiSS1定位于1号染色体长臂lq32q41区[67]，编码一个大小为145个氨基酸的亲水性蛋白，其中，含54个氨基酸、末端羧基酰胺化的残基片段是孤儿G蛋白偶联受体(orphan G proteincoupled recepter, GPR54)的内源性天然配体，被命名为metastin[8]。metastin与其受体GPR54结合后引起一系列生理生化改变，从而抑制肿瘤转移[9]。研究发现，KiSS1缺失表达与胃癌、食管鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、膀胱癌和子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关[1018]。但在HCC的研究中，Ikeguchi等和Schmid等发现 A：未转染组细胞;B：空载体组MHC/pcDNA3.1细胞;C：转染组MHC/KiSS1细胞.　　KiSS1的过表达与HCC的进展相关，这与KiSS1抑制肿瘤侵袭转移的作用相悖[45]。因此深入研究KiSS1基因的表达与HCC侵袭、转移及预后的关系是必要的。　　本研究构建了真核表达载体pcDNA3.1/HisC/KiSS1，并经PCR、酶切及测序进行鉴定，结果证实了KiSS1基因cDNA片段正确插入真核表达载体中，载体构建成功。用脂质体介导MHCC97H细胞转染后，RTPCR、免疫细胞化学和Western blot方法分别从mRNA和蛋白水平进行鉴定，结果显示，与未转染组和空载体组细胞KiSS1基因的不表达相比，转染组细胞其KiSS1基因在mRNA和蛋白水平出现了较强的表达，证实KiSS1基因已转染入HCC细胞中。此结果说明本研究构建的pcDNA3.1/HisC/KiSS1载体在MHCC97H细胞内能瞬时表达KiSS1基因，为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。【参考文献】　　[1] 朱明华. 脏肿瘤病理学研究展望[J]. 中华病理学杂志, 2007,36(11):721722.　　[2] Yoshida B A,Sokoloff M M,Welch D R, et al. Metastasissuppressor genes: a review and perspective on an emerging field[J]. J Natl Cancer Inst, 2000,92(21):17171730.　　[3] 刘 虎,叶胜龙. 肿瘤转移抑制基因的功能定位克隆研究[J]. 癌症, 2003,22(11):12371240.　　[4] Ikeguchi M,Hirooka Y,Kaibara N. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis for KiSS1 and orphan Gproteincoupled receptor (hOT7T175) gene expression in hepatocellular carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2003,129(9):531535.　　[5] Schmid K,Wang X,Haitel A, et al. KiSS1 overexpression as an independent prognostic marker in hepatocellular carcinoma: an immunohistochemical study[J]. Virchows Arch, 2007,450(2):143149.　　[6] Lee J H,Miele M E,Hicks D, et al. KiSS1, a novel human malignant melanoma metastasissuppressor gene[J]. J Natl Cancer Inst, 1996,88(23):17311737.　　[7] West A,Vojta P J,Welch D R, et al. Chromosome localization and genomic structure of the KiSS1 metastasis suppressor gene (KiSS1)[J]. Genomics, 1998,54(1):145148.　　[8] Ohtaki T,Shintani Y,Honda S, et al. Metastasis suppressor gene KiSS1 encodes peptide ligand of a Gproteincoupled receptor[J]. Nature, 2001,411(6837):613617.　　[9] Yuan B Z,Zhou X,Zimonjic D B, et al. Amplification and overexpression of the EMS1 oncogene, a possible prognosticmarker, in human hepatocellular carcinoma [J]. J Mol Diagn, 2003, 5(1):4853.　　[10] Dhar D K,Naora H,Kubota H, et al. Downregulation of KiSS1 expression is responsible for tumor invasion and worse prognosis in gastric carcinoma[J]. Int J Cancer, 2004,111(6):868872.　　[11] 姚宏亮,杨竹林,李永国,等. 转移抑制基因KiSS1和KAI1在胃癌组织中表达的原位杂交研究[J]. 中华胃肠外科杂志, 2007,10(3):274277.　　[12] Ikeguchi M,Yamaguchi K,Kaibara N. Clinical significance of the loss of KiSS1 and orphan Gproteincoupled receptor (hOT7T175) gene expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(4):13791383.　　[13] 王春晖,乔 宠,戴显伟,等. 人胰腺癌KiSS1基因mRNA表达及其临床意义[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006,13(3):207210.　　[14] Masui T,Doi R,Mori T, et al. Metastin and its variant forms suppress migration of pancreatic cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,315(1):8592.　　[15] Ringel M D,Hardy E,Bernet V J, et al. Metastin receptor is overexpressed in papillary thyroid cancer and activates MAP kinase in thyroid cancer cells[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002,87(5):23992402.　　[16] Mitchell D C,Stafford L J,Li D, et al. Transcriptional regulation of KiSS1 gene expression in metastatic melanoma by specificity protein1 and its coactivator DRIP130[J]. Oncogene, 2007,26(12):1739 1747.　　[17] SanchezCarbayo M,Capodieci P,CordonCardo C. Tumor suppressor role of KiSS1 in bladder cancer: loss of KiSS1 expression is associated with bladder cancer progression and clinical outcome[J]. Am J Pathol, 2003,162(2):609617.　　[18] 姜 涛,陆春雪,张淑兰,等. 肿瘤转移抑制基因KiSS1在子宫内膜癌组织中的表达及意义[J]. 中国现代医学杂志, 2006,16(13):19331936.