原癌基因PIK3CA在宫颈癌组织中的表达及意义

作者：王洪艳，崔竹梅，刘湘萍，隋爱华，杨堃，孙显路    作者单位：青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003

  【摘要】  目的 研究原癌基因PIK3CA在宫颈癌组织中的表达及其意义。方法 用RTPCR方法检测PIK3CA mRNA在15例正常宫颈组织和30例宫颈癌组织中的表达,免疫组化方法检测其蛋白在50例宫颈癌前病变组织及20例宫颈癌组织中的表达情况。结果 从宫颈上皮内瘤样病变(CIN)到宫颈癌的发展过程中，PIK3CA的蛋白表达产物PI3K p110a蛋白表达水平逐渐增加(Hc=9.968,P<0.05)； PIK3CA mRNA在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达差异有显著性(t=2.672,P<0.05)。结论 PIK3CA基因改变与宫颈癌的发生发展有关，宫颈癌的发展过程伴随着PI3K p110a蛋白的表达异常。

【关键词】  宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤样病变；原癌基因蛋白质PIK3CA；免疫组织化学

　　EXPRESSION OF PROTOONCOGENE PIK3CA IN UTERINE CERVICAL CANCER

　　WANG HONGYAN, CUI ZHUMEI, LIU XIANGPING, et al

　　(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); 　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the expression of protooncogene PIK3CA in cervical cancer and its significance.MethodsThe expressions of PIK3CA mRNA in normal cervical tissue (15 cases) and cervical cancer tissue (30 cases) were detected by RTPCR, and PIK3CA protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN, 50 cases) and cervical cancer (20 cases) detected by immunochemistry.ResultsThe expressions of PIK3CA mRNA were significantly different between the tissues of normal cervix and cervical cancer (t=2.672,P<0.05). In the process from CIN to cervical cancer, the PIK3CA protein products (PI3K and p110a) increased dramatically (Hc=9.968,P<0.05).ConclusionThe changes of PIK3CA gene is related to the morbidity of cervical cancer, the process of the cancer is followed by increasing expression of PI3K and p110a protein.

    ［KEY WORDS］Cervix neoplasms; Cervical intraepithelial neoplasia; Protooncogene proteins PIK3CA; Immunohistochemistry

    宫颈癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，流行病学研究显示，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒（HPV）感染关系密切。生育期妇女中HPV感染非常普遍，然而只有一小部分妇女发生宫颈癌,因此,除了HPV感染以外宫颈癌的发生还存在其他的必要因素。与其他肿瘤一样，宫颈癌的发生也被认为是与癌基因激活或抑癌基因失活有关的多步骤的发展过程[1]。PIK3CA，编码磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的 p110a亚基，已被证实是一种癌基因，人类多种恶性肿瘤中都存在该基因的突变。本实验应用免疫组化方法和RTPCR方法,检测PIK3CA在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达变化,以探讨其在宫颈癌发生与发展中的作用。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本及其来源

    宫颈鳞癌组织标本30例, 病人年龄28～49岁，平均39.13岁，术前均未进行放疗或化疗，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期8例；高分化10例，中分化12例，低分化8例。所有标本均取自青岛大学医学院附属医院妇科住院的病人。标本取得后一部分迅速置于-80 ℃超低温冰箱保存备用,其余送病理科进行病理学诊断, 其中20例宫颈鳞癌组织标本（高分化6例，中分化9例，低分化5例）同时进行石蜡包埋，制成组织切片备用。正常对照标本15例,均为子宫肌瘤手术切除的正常宫颈组织。另外,对本院病理科2004～2006年间50例石蜡包埋的宫颈组织切片进行回顾性分析，其中正常宫颈切片15例，宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ者10例， CINⅡⅢ者25例。

　　1.2  PIK3CA蛋白表达产物PI3K p110a蛋白检测

    采用免疫组织化学PV6000二步法。试剂兔抗人PI3 Kinasep110alpha抗体购自CellSignaling Technology公司，工作浓度为1∶25；通用型PV6000二步法免疫组化检测试剂盒购自中杉金桥公司。组织切片脱蜡处理后水化，灭酶，然后置于0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中,微波炉加热至95 ℃共10～15 min进行抗原修复,按照试剂盒说明书依次滴加一抗、通用型二抗,最后切片经梯度乙醇脱水,干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,显微镜观察结果。

    结果判断：用已知的阳性对照片作阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照。PI3K p110a蛋白阳性染色位于胞浆。高倍镜下随机选4个视野，结合阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分级，然后取平均值。染色强度判定标准如下：胞浆内无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分率判定：阳性细胞百分率<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项结果相加＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，6～7分为强阳性()。

　　1.3  PIK3CA mRNA表达水平的检测

　　1.3.1  总RNA提取及逆转录

　　按Trizol试剂（购自Invitrogen公司）说明书提取组织总RNA，并测定RNA纯度，按照MMLV反转录试剂盒（购自Promega公司）推荐的50 μL体系进行逆转录反应，合成cDNA。

　　1.3.2  引物序列

　　PIK3CA（Genbank NO:NM006218）:上游引物5′CCCTGCTCATCAACTAGGAAACC3′,下游引物5′TTGCCGTAAATCATCCCCATT3′，共160 bp。GAPDH(Genbank:NM002046):上游引物5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′, 下游引物5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′,共226 bp。引物由上海生工公司合成。

　　1.3.3  PCR反应

　　以合成的cDNA作为反应模板, 反应体系100 μL，包括cDNA 20 μL，dNTP混合物（10 mmol/L ）1.8 μL，MgCl2（25 mmol/L）7.5 μL，10×逆转录缓冲液 9.8 μL，上下游引物各50 pmol，Taq DNA聚合酶2.5 U，加无RNA酶水至终体积100 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。内参照物为GAPDH，反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共28个循环;最后72 ℃延伸10 min。

　　1.3.4  PCR产物半定量分析

　　将上述扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外线透射凝胶成像仪上观察电泳条带，并经扫描系统分析其灰度值，以PIK3CA/GAPDH表示PIK3CA mRNA的相对表达水平，采用分析软件对电泳条带进行半定量分析，最后将PCR产物送上海生工公司进行测序。

　　1.4  统计学分析

    应用SPSS 11.5软件进行数据处理，数据间比较采用t检验、方差分析和秩和检验。

　　2  结果

　　2.1  宫颈癌组织PI3K p110a蛋白的表达

    PIK3CA基因表达产物PI3K p110a蛋白在各组织中表达情况见表1。PI3K p110a蛋白在宫颈癌组织中强阳性表达最高，而在正常宫颈和CINⅠ组中无强阳性表达，其在正常宫颈、CINⅠ、CINⅡⅢ、宫颈癌间表达差异有统计学意义（Hc=9.968,P<0.05）；两两比较显示，正常宫颈和CINⅠ组之间差异无显著性（P>0.05），而CINⅠ组、CINⅡⅢ组与宫颈浸润癌组织间差异均有显著性（P<0.05）。表1  各组PI3K p110a蛋白的表达（略）

　　2.2  宫颈癌PIK3CA mRNA的表达

    将PCR产物测序所得序列与Genbank公布的PIK3CA序列进行比对，证实PCR扩增产物为PIK3CA。30例宫颈癌组织有12例PIK3CA mRNA高表达， 而15例正常宫颈组织无PIK3CA mRNA高表达（图1）。宫颈癌组织PIK3CA mRNA表达水平为1.24±0.53，正常宫颈组织为0.89±0.09，两者比较，差异有显著意义（t=2.672，P<0.05）。相关分析显示，PIK3CA mRNA表达与肿瘤分期和分化程度无关（P>0.05）。

　3  讨 论

    宫颈癌是女性较常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位。全世界每年大约有20万妇女死于这种疾病。在发达国家，宫颈癌发病率已明显下降，这主要归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗。在发展中国家，由于宫颈疾病筛查工作不完善，女性对宫颈疾病的忽视，致使我国宫颈癌的发病率是发达国家的6倍，而且宫颈癌的发病年龄也越来越年轻化。流行病学研究显示，宫颈癌的发生与HPV感染关系密切，尤其是高危型HPV感染[2]。尽管在生育期妇女中HPV感染非常普遍，然而只有一小部分妇女发生宫颈上皮内瘤样病变（CIN），发展到浸润性癌的就更少了，因此HPV感染并不是独立致病因素。基因突变是恶性肿瘤发生发展的根本原因，而与细胞生长调控有关的基因突变在肿瘤形成中尤为常见，与其他肿瘤一样，宫颈癌的发生也被认为是与癌基因激活或抑癌基因失活有关的多步骤的发展过程。

    3号染色体长臂的扩增是宫颈癌中最常存在的基因改变,也与宫颈不典型增生细胞演化为侵袭性癌有关,PIK3CA 定位于3号染色体3q26.3，编码IA类磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的p110a催化亚单位，全长34 kb，包含20个外显子，编码1 068种氨基酸，产生相对分子质量为124 000 的蛋白。PI3K及其下游分子丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)所组成的信号通路调控细胞的正常生长和凋亡，是近年来肿瘤研究中的热点。信号途径中某些成分的突变所导致的功能获得或功能缺失使该途径被激活，从而导致异常的细胞周期演进，细胞活力和黏附能力改变，凋亡受抑制，血管生成增加，导致肿瘤细胞的增殖和存活。在多种人类恶性肿瘤组织中存在频繁的PI3K/AKT信号通路的异常改变[5]。

    PIK3CA已被证实是一种癌基因，由于PIK3CA基因突变导致的PIK3CA的过度表达可以导致PI3K的催化活性增强，促使细胞癌变[3]。在人类多种肿瘤，如卵巢癌、胃癌、结肠癌、头颈部鳞癌等都存在该基因的突变。SHAYESTEH等[4]和MA等[5]分别在卵巢癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌细胞系中证实PI3K活性升高,并证实PI3K活性升高与基因依赖性的p110a催化亚基过度表达,PIK3CA的基因产物p110a表达增加有关。 SAMULELS等[6]研究证明，PIK3CA基因突变主要集中在两个小的保守编码区域内,催化结构域和螺旋状结构域,这种非随机高频“热点突变”显示了PIK3CA在肿瘤发生中的重要意义， PIK3CA基因突变可增加肿瘤细胞的转移和侵袭能力。

    本文研究结果显示，PIK3CA mRNA在宫颈癌组织中表达明显高于正常组织；PIK3CA基因的表达产物PI3K p110a蛋白在正常宫颈和CINⅠ组之间无差异，而在CINⅠ组、CINⅡⅢ组与宫颈浸润癌组织间均有显著性差异。说明在宫颈癌形成过程中存在PIK3CA的表达异常，而PIK3CA高表达可能是宫颈癌形成过程中的早期事件，与宫颈不典型增生演化到宫颈癌有关。GOTO等[7]以宫颈液基细胞学标本为研究对象进行免疫组化研究结果表明，PIK3CA可以作为宫颈早期上皮病变中肿瘤形成的相关标志,与本实验结果一致。

    综上所述，PIK3CA过度表达通过激活PI3K/AKT信号传导途径,可以导致肿瘤的发生发展,因此,在宫颈癌的发生发展中起一定的作用。并且PIK3CA表达异常与宫颈不典型增生演化到宫颈癌有关,有可能成为宫颈癌早期诊断的指标。

【参考文献】  　　[1]WOLF J K, RAMIREZ P T. The molecular biology of cervical cancer[J]. Cancer Invest, 2001,19:621629.

　　[2]闫志勇,王景和,姜健阁. 宫颈癌高危人群HPV16及18感染检测方法的建立[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,40(1):7071.

　　[3]KANG S, BADER A G, VOGT P K. Phosphatidylinositol 3kinase mutations identified in human cancer are oncogenic[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:802807.

[4]SHAYESTCH L, LU Y, KUO W L, et al. PIK3CA is implicated as an oncogen in ovarian cancer[J]. Nature Genet, 1999,21:99103.

　　[5]MA Y Y, WEI S J, LIN Y C, et al. PIK3CA as an oncogen in cervical cancer[J]. Oncogene, 2000,19:27392744.

　　[6]SAMUELS Y, WANG Z, BARDELLI A, et al. High frequency of mutation of the PIK3CA gene in human cancers[J]. Science, 2004,304(5670):554.

　　[7]GOTO T, TAKANO M, SASA H, et al. Clinical significance of immunocytochemistry for PIK3CA as a carcinogenesisrelated marker on liquidbased cytology in cervical intraepithelial neoplasia[J]. Oncol Rep, 2006,15:387391.