心肌特异性Hsp27对ISO诱导小鼠心肌肥厚的保护作用

　　作者： 顾明霞 程蕴琳 刘莉 张小进 高翔

　　作者单位：210029江苏省南京市, 南京医科大学第一附属医院老年医学科;210061江苏省南京市,南京大学模式动物研究所

　　【关键词】 热休克蛋白质,小鼠,转基因,心肌疾病;,,异丙肾上腺素,

　　【摘要】 目的 探讨人热休克蛋白(Hsp27)基因产物对异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥厚的影响。 方法 以本研究室建立的心肌特异性表达Hsp27转基因(TG)小鼠为模型，腹腔注射ISO[30 mg/(kg?d)]共7 d。实验在规定时间结束后，测定心脏质量与胫骨长度的比值(HW/TL)、心脏二维超声(echo)， Masson三色染色观察心肌纤维化改变，各组均以野生型鼠(WT)为对照组。 结果 (1)ISO处理使TG鼠和WT鼠的HW/TL 与生理盐水处理对照组比较分别增加了746%和1765%,WT组增加比率有统计学差异(P<001);(2)echo显示ISO使TG心脏收缩期后壁厚度增加(P<005)，而WT组心脏前、后壁在收缩、舒张末期均有显著的增加(P<005～001)。(3)每搏输出量、短轴缩短率、心脏射血分数没有统计学差异。WT鼠心肌纤维化明显多于TG鼠。 结论 Hsp27可显著抑制ISO诱导的小鼠早期心肌重构。其机制有待进一步探讨。

　　【Abstract】　Objective To establish transgenic (TG) mice that overexpressed heat shock protein 27 (Hsp27) and then to determine the effects of Hsp27 on the isoproterenol(ISO)induced cardiac hypertrophy in early period. Methods A cDNA encoding human Hsp27 was subcloned into SalIHindIII sites of pBSⅡSK+ containing the αMHC promoter， then microinjected into pronuclei of fertilized eggs from CBA mice. Isoproterenol was administered intraperitoneally [30 mg/(kg?d)] for 7 days. The control mice were injected with physiological saline [30 mg/(kg?d)] for 7 days. Then the protection effects of overexpression of Hsp27 on the isoproterenolinduced cardiac hypertrophy in early period were determined. Results (1) Cardiac weighttotibia length (TL) ratio was increased by 746% and 1765% in TG group and WT group (P<001) ; (2) The echocardiographic measurement of LVSPWD，LVSAWD，LVDPWD，LVDAWD in WT group was increased after injection of isoproterenol(P<005-001); (3) Masson’s trichrome staining for the detection of fibrosis showed that cardiomyocyte hypertrophy as fibrosis in WT group. Conclusions The over expression of human Hsp27 may inhibit isoproterenolinduced cardiac hypertrophy in early period.

　　【Subject　words】 Heatshock proteins; Mice,transgenic; Myocardial diseases; Isoproterenol

　　心肌肥厚是老年人多种常见心脏疾病所伴有的病理改变，临床研究证明心肌肥厚是心脏病发病率和病死率的独立的危险因子[1]。随着年龄的增加，危险性增高。因此研究心肌肥厚的分子机制并行靶向干预显得尤为重要。

　　热休克蛋白27(heat shock protein 27，Hsp27)，以心肌细胞和神经原等未分化细胞表达最为丰富[2]。已证实Hsp27在神经细胞、体外培养的心肌细胞内有抗氧化作用[3]。在异丙肾上腺素(isoproteronol，ISO)诱导的心肌肥厚病理发生过程中，氧化应激和细胞凋亡是重要的分子基础。Hsp27是否可以干预这个过程，目前还不清楚。我们将建立Hsp27心肌特异性高表达转基因(TG)鼠，在此基础上，观察Hsp27对ISO诱导的心肌肥厚病理发生的影响。

　　1 材料和方法

　　11 动物 Hsp27的TG鼠由本研究室构建。通过聚合酶链反应(PCR)筛选含有Hsp27的TG小鼠。再将筛选的TG阳性鼠与野生型(WT)C57BL6鼠繁殖，取第6代后的小鼠进行实验。

　　12 方法

　　121 Hsp27 TG阳性及阴性小鼠PCR筛选：取2周大小的小鼠尾巴约08 cm，组织裂解，提取DNA进行PCR，上游引物是与cDNA Hsp27互补的5’GGTGCTTCACGCGGAAATACAC3’，下游是与HGH polyA区互补的5’GCCCTACAGGTTGTCTTCCCAA3’。筛选阳性鼠及阴性对照鼠。通过蛋白印迹验证Hsp27在心肌组织中持续高表达。

　　122 心肌肥厚模型的建立：TG鼠和WT鼠，共40只，雌雄各半，鼠龄平均(10±2)周，体质量平均(25±5)g。共分2组：(1)实验组，ISO(美国Sigma公司) 30 mg/(kg?d)，持续7 d;(2)对照组，等体积腹腔注射生理盐水。

　　123 心脏二维超声：1%戊巴比妥01 ml /只，麻醉后剃毛，暴露胸部，由专科医生进行心脏二维超声(Acuson sequoia 512, 15L8，探头频率13MHz)测定，保存M超声图像并测量相关指标。

　　124 蛋白印迹：取-80 ℃保存的组织，冰上以组织裂解液Buffer A液(10 mmol/L HEPES pH 79, 10 mmol/L KCl, 01 mmol/L EDTA, 01 mmol/L EGTA， 1 mmol/L DDT，Roche混合型蛋白酶抑制剂2 mmol/L, 20 mmol/L PNPP) 05 ml匀浆, 离心(10 000 r/min，时间2 min,温度4 ℃), 上清为胞浆总蛋白。BCA法定量蛋白质浓度，100 μl/管分装后-80℃保存待用。等体积(25 μl) 蛋白质经10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDSPAGE) 分离后,转移到免疫印迹膜(美国milipore 产品)， 5% 脱脂牛奶室温孵育1 h，鼠抗人Hsp27 单克隆抗体(1∶4 000) 4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶-标记山羊抗小鼠IgG (H + L)，英国vector 产品(1∶40 000) 室温2 h，ECL(美国Pierce 产品) 显色,并曝光于X 线胶片(美国Kodak 产品) 。

　　125 组织学检测：心脏在4%多聚甲醛浸泡、4℃过夜后，常规脱水、石蜡包埋，切成厚度4 μm的薄片(英国Shandon finesse325切片机)，Masson三色染色(蔡氏倒置荧光显微镜摄取图象)。

　　126 统计学分析：所有数据采用SPSS 100 统计软件进行分析, 数据用 ±s 表示, 采用成组t 检验分析方法。

　　2 结果

　　21 蛋白质印迹分析结果 line85,line112小鼠心脏组织蛋白分析结果，Hsp27在TG阳性鼠心肌组织中高表达，阴性鼠中无表达。小鼠的肝、脾、肺、肾、心、脑、骨骼肌各组织中，仅心脏组织中有Hsp27表达。见图1。 图1 小鼠心脏Hsp27检测及心肌特异性高表达(略)

　　2.2 小鼠心脏/胫骨长度比值(HW/TL) 比较结果见图2。图2 各组小鼠HW/TL比值(略)

　　23 超声心动学测定 WT组小鼠收缩、舒张末期前后壁的厚度在ISO作用后均明显增厚，P均<001。而TG组仅收缩期后壁厚度增加明显，P<005，其余指标无统计学差别。见表1及图3。表1 2组小鼠ISO干预前后超声检查指标比较(略)心率;LVDD：左室舒张期末直径;LVSD：左室收缩期末直径;EDV：左室舒张末容积;ESV：左室收缩末容积;EF：射血分数; FS：短轴缩短率;LVSPWD：左室收缩末期后壁厚度;LVSAWD：左室收缩末期前壁厚度; LVDPWD：左室舒张末期后壁厚度;LVDAWD：左室舒张末期前壁厚度。与ISO干预前比较 *P<005 **P<001

　　24 ISO诱导的心肌纤维化改变 Masson三色染色，红色为正常的心肌细胞，蓝色为纤维组织，棕色为细胞核，见封四图4。WT组：在ISO作用后，5倍放大可观察到纤维化弥漫分布在心肌组织，TG组：在同样注射ISO后没有纤维化产生。各对照组均未发现心肌细胞间纤维组织增生。将纤维化组织及对照组局部放大40倍后观察到，正常的心肌细胞被蓝色的纤维组织代替，心肌细胞代偿性肥大。

　　A：ISO作用WT组纤维化(黑箭)弥漫分布在心肌组织中，TG组及对照组未见明显纤维化(×5);B：ISO作用WT组正常的心肌细胞被蓝色的组织代替，心肌细胞代偿性肥大(×40)

　　3 讨论

　　本实验通过ISO作用Hsp27 高表达TG小鼠，论证了Hsp27在小鼠心脏整体水平具有抗心肌重构的作用。Hsp27 TG阳性鼠HW/TL比值无明显增加，而阴性鼠则有统计学差异，二维超声进一步证实心肌显著增厚，而EF、FS等心功能指标，由于在早期没有明显的统计学差异。Masson三色染色发现阴性鼠在ISO作用后纤维化成团簇状，散在分布于心肌组织。Hsp27高表达对ISO诱导的心肌肥厚在心功能代偿早期有一定的抑制作用，这个内在机制与Hsp27抗氧化作用是相关的。

　　氧化应激作为心血管疾病的一个新的研究热点，研究表明心脏在缺血再灌注损伤、高负荷、环境应激等情况下活性氧( reactive oxygen species，ROS)的产生会增加，影响细胞内正常的信号通路及心肌基因的表达 [45]，是心肌重构、冠心病、心衰等心脏疾病重要的机制 [67]。慢性的ROS的释放对心肌纤维化、胶原纤维的沉积、金属蛋白酶的激活等心肌重构有重要作用[8]。

　　Hsp27又名HspB1，能抵抗各种应激反应，包括热休克、氧化应激[911 ]、炎症因子等。Hsp27发挥抗氧化作用途径包括：①非特异性保护作用：促进谷胱甘肽的还原，显著提高细胞内葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽转移酶量。升高细胞内还原型谷胱甘肽/ 氧化型谷胱甘肽( GSH/ GSSG) 比例。Hsp27寡聚体如何提高G6PDH水平还不清楚，可能与G6PDH mRNA水平的表达有关[1214]。②Hsp27是细胞内一个有效的离子清除剂或螯合剂，是有效的抗氧化剂，能减少细胞内铁离子的浓度。铁是OH-离子产生的促酶剂,细胞内高浓度的铁能刺激氧化损伤。具体机制与Hsp27抑制了铁调节蛋白1，2 的活性有关[15]。③一些证据表明Hsp27是非ATP依赖的伴侣蛋白[16]，能够与错误折叠的多肽结合，中和有毒蛋白的聚集，使它们避免发生氧化反应或促进其恢复，如果不能去氧化则促使他们快速降解。ROS使蛋白发生的氧化，脂质的过氧化，NFκB的激活，F肌动蛋白的结构的解体，均能被Hsp27的表达所抑制。此外Hsp27还能协助蛋白质靶向作用于线粒体外膜，稳定线粒体膜电位，平衡ROS的产生与清除。

　　Hsp27高表达对ISO诱导的心肌肥厚在心功能代偿早期就有显著抑制作用，下一步我们将更进一步明确以上保护机制，对心肌组织进行氧化产物及细胞凋亡的检测，来进一步明确Hsp27保护心肌早期重构的分子机制，这将对心肌老化、心肌重构的预防及治疗，缓解心脏从代偿向不可逆衰竭的发展提供一个新靶点及治疗思路。

　　参考文献

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