MMP2、PTEN在骨肉瘤组织中的表达及临床意义

作者:解思信

 作者单位：青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003

    【摘要】  目的 探讨基质金属蛋白酶2 (MMP2)及张力蛋白和辅助蛋白同源、第10号染色体丢失的磷酸酶(PTEN)的表达在骨肉瘤发生、发展中的作用及其相互关系。方法 应用免疫组化SP法检测40例骨肉瘤组织、20例骨软骨瘤组织中MMP2、PTEN蛋白的表达情况，并分析两者之间表达的相关性。结果 MMP2在骨肉瘤组织中的阳性率为65%（26/40），而在骨软骨瘤组织中的阳性率为0，差异具有显著性（χ2=7.253，P<0.01）。PTEN蛋白在骨肉瘤组织中的阳性表达率为55%（22/40），而在骨软骨瘤组织中为90%（18/20），两者相比差异有统计学意义（χ2=4.164，P<0.05）。在骨肉瘤组织中，MMP2和PTEN表达强度之间呈负相关（r=-0.403，P<0.05）。结论 MMP2和PTEN与骨肉瘤的发生、发展以及侵袭、转移有关，且两者具有相关性，联合检测MMP2和PTEN的表达将对骨肉瘤的早期诊断、预后判断有一定指导意义。

【关键词】  骨肉瘤 明胶酶A PTEN 免疫组织化学

    骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，恶性程度高，预后较差。转移是骨肉瘤病人死亡的主要原因，也是肿瘤治疗中的一大难题。肿瘤细胞在侵袭转移过程中必须破坏由细胞基质及基膜构成的细胞外基质屏障（ECM），而在参与破坏ECM的酶类中基质金属蛋白酶（MMPs）与肿瘤侵袭转移的关系最为密切。基质金属蛋白酶2（MMP2）属于明胶酶，是一种锌离子依赖蛋白酶，激活的MMP2在肿瘤侵袭转移中发挥着关键性作用。抑癌基因的失活是导致肿瘤发生的原因之一。张力蛋白和辅助蛋白同源、第10号染色体丢失的磷酸酶(PTEN)是1997年被发现的第一个具有酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因。研究显示，PTEN与多种肿瘤如胶质母细胞瘤、乳癌、前列腺癌等有关，但PTEN在骨肉瘤中的作用目前仅有少量报道且认识不一致。本研究采用免疫组化SP法对MMP2和PTEN在骨肉瘤组织标本中的表达及其相互作用进行了初步研究。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源

    收集青岛大学医学院附属医院骨科2001年1月～2005年6月手术切除标本，其中骨肉瘤标本40例，均经病理检查证实。40例病人中，男28例，女12例；平均年龄19.6岁（9～60岁）。Enneking外科分期：Ⅰ级8例，Ⅱ级21例，Ⅲ级11例。组织学分型：骨母细胞型16例，纤维母细胞型13例，软骨母细胞型7例，其他类型（血管扩张型、混合型）4例。选取同期青岛大学医学院附属医院病理科存档骨软骨瘤标本20例作为对照。标本均经100 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片。

    1.2  检测方法

    采用免疫组化SP法。鼠抗人MMP2单克隆抗体和鼠抗人PTEN单克隆抗体以及SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，体积分数0.03的过氧化氢室温孵育10 min，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，正常羊血清封闭20 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，中性树胶封固。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.3  结果判定

    参照FROMOWITZ等级方法进行，每张切片随机选取10个高倍视野，计数染色阳性细胞，取平均值，计算阳性细胞百分率。按着色程度分为：基本未着为0分；着浅色为1分；中度着色为2分；强阳性着色为3分。按阳性细胞百分率分为：染色细胞数≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。将每张切片着色强度与着色细胞百分率得分相乘，为其最后得分。其中：0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+）；4～5分为中度阳性（）；≥6分为强阳性（）。

  1.4  统计学分析

    采用SPSS 10.0软件包中的χ2检验、Spearman等级相关进行统计学处理。

    2  结    果

    2.1  MMP2、PTEN在骨肉瘤、骨软骨瘤组织中的表达

    MMP2阳性染色主要定位于肿瘤细胞的胞浆或胞膜上，为棕黄色颗粒。PTEN阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞浆，亦为棕黄色颗粒。MMP2在骨肉瘤组织中的表达率为65%（26/40），显著高于其在骨软骨瘤组织中的表达率（0），差异有显著意义（χ2=7.253，P<0.01）。PTEN在骨肉瘤组织中的表达率为55%（22/40），显著低于其在骨软骨瘤组织中90%（18/20）的表达率，差异具有显著性（χ2=4.164，P<0.05）。

    2.2  MMP2、PTEN在骨肉瘤组织中的表达与临床病理特征的关系

    MMP2、PTEN在不同性别、年龄及病理类型的骨肉瘤组织中的表达差异无显著性（P>0.05）。MMP2在各Enneking外科分期骨肉瘤组织中的阳性表达差异有显著性（χ2=6.538，P<0.05），随着Enneking外科分期的增高，MMP2阳性表达强度也呈增强趋势。PTEN阳性表达率与骨肉瘤的肺转移相关（χ2=3.961，P<0.05）。见表1。

    2.3  MMP2、PTEN在骨肉瘤组织中表达相关性

    MMP2与PTEN在骨肉瘤组织中的表达呈显著负相关（r=-0.403，P<0.01）。见表2。表1  MMP2、PTEN在骨肉瘤组织中的表达与临床病理特征的关系[例表2  MMP2、PTEN在骨肉瘤组织中表达的相关性（例）PTENnMMP2+～-+～22814-18180

    3  讨    论

    恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多环节、多步骤的复杂过程，在肿瘤浸润转移过程中，肿瘤细胞穿越ECM和基底膜这些自然屏障时，必须依赖于能降解ECM和基底膜成分的分泌[1]。MMPs是肿瘤细胞分泌的主要基质降解酶之一，它能降解所有ECM成分，其中MMP2在肿瘤介导的ECM降解中起关键作用[2]。MMP2能降解Ⅳ型胶原，促进肿瘤血管形成和影响细胞间黏附作用。华成舸等[3]研究显示，骨和软组织恶性肿瘤与良性肿瘤中的MMP2表达率有显著性差异。MMP2能切断基底膜的支架即Ⅳ型胶原，破坏小血管、淋巴管的基底膜，从而引起血行和淋巴转移。同时，MMP2降解肿瘤细胞ECM，亦造成骨肉瘤的局部浸润。MIYAKE等[4]研究显示，表达MMP2的肿瘤细胞株穿越基底膜的数量远远大于对照组，表明MMP2降解基底膜能力与细胞浸润转移能力密切相关。多项研究表明，MMP2的表达与肿瘤的转移及侵袭程度密切相关，是肿瘤恶性进展的标志[5]。SIER等[6]研究结果显示，MMP2的表达与肿瘤的转移及较差的预后密切相关。本研究显示，40例骨肉瘤标本中，MMP2阳性率为65%，而骨软骨瘤中MMP2的阳性率为0，差异具有显著性。MMP2在骨肉瘤Enneking外科分期各期中的阳性表达率有显著性差异。随着Enneking外科分期的增高，MMP2的阳性表达程度也增高，说明MMP2表达的增强有可能促进了骨肉瘤的浸润转移。

    PTEN基因位于人类10q23，是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能使磷酸化的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸去磷酸化，通过去磷酸化作用而发挥抑癌功能。PTEN基因编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用，可负向调节PI3K/Akt信号通路，对抗PI3K途径转导的生长和生存信号，抑制肿瘤的发生和发展。肿瘤组织中PTEN基因突变导致其磷酸酶活性剧降，肿瘤细胞恶性增殖能力增强[7]。PTEN基因在不同肿瘤组织中突变率的差异可能与不同组织类型有关。刘伟等[8]对43例非小细胞肺癌组织和20例癌旁正常肺组织PTEN表达情况的研究显示，PTEN在肺癌组织中的表达率为46.5%，而在癌旁组织中的表达率为95.0%，两组间比较差异有显著性。PTEN蛋白的表达与肺癌组织的细胞分化程度、淋巴结转移以及病人的预后密切相关。但在骨肉瘤中的表达情况报道较少。LEVINE等[9]报道，在犬的骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中都可看见PTEN蛋白表达下降。本研究结果表明，PTEN蛋白在骨肉瘤与骨软骨瘤中阳性表达率的差异均有显著性，提示PTEN蛋白在骨肉瘤中表达下降，从而失去对细胞周期的负调控功能，细胞异常增殖，导致肿瘤的发生。并且，PTEN还与骨肉瘤肺转移有显著相关性。 PTEN可以作为骨肉瘤预后判断的一个指标。

关于MMP2和PTEN相关性方面的研究，国外已有类似报道。FURUKAWA 等[10]研究表明,把野生型PTEN基因导入脑恶性胶质瘤细胞中后，MMP2 mRNA水平降低，MMP2和MMP9的活性受到抑制，并且发现MMPs抑制剂TIMP2表达水平上调。TAO等[11]通过对41例胰头癌组织和10例正常胰腺组织中的PTEN、MMP2等蛋白阳性表达率进行比较，结果随着PTEN表达强度的增强，MMP2等的标记指数亦随着下降，差异有显著意义，表明PTEN和MMP2之间有明显的负相关。但二者在骨肉瘤中的相关性国内外还未见报道。本研究结果显示，在骨肉瘤组织中，二者具有相关性。目前，关于二者协同作用的机制仍然未完全明确，有待进一步研究。

    综上所述，MMP2、PTEN参与骨肉瘤发生发展过程，在肿瘤的浸润转移过程中二者具有协同作用。通过往人体内导入野生型PTEN降低MMP2蛋白含量，或者使用选择性MMPs抑制剂可能会预防肿瘤发生和早期浸润转移。深入研究MMP2和PTEN协同作用方面的机制，将会对恶性肿瘤的预防、临床治疗及病人的预后判断有重要的影响。

【参考文献】  [1]KLEINER D E, STETLERSTEVENSON W G. Matrix metalloproteinases and metastasis[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1999,43(1):4251.

[2]封国生,谭毓铨. 基质金属蛋白酶及Ⅳ型胶原在胃癌中的表达及意义[J]. 中华外科杂志， 2000,38(9)：775777.

[3]华成舸,温玉明,王昌美,等. 骨和软组织肿瘤中明胶酶的定位与活性分析[J]. 华西医科大学学报, 2002,31(1):8285.

[4]MIYAKE H, HARA I, GOHJI K, et al. Relative expression of matrix metalloproteinases2 and tissue inhibitor of metalloproteinasess in mouse renal cell carcinoma cells regulates their metastatic poteintial[J]. Clin Cancer Res, 1999,5(10):28242829.

[5]ROYE G D, MYERS R B, BROWN D, et al. CD44 expression in dyeplastic epithetlim and squamouscell carcinoma of the esophagus[J]. Int J Cancer, 1996,69(4):254.

[6]SIER C F, KUBBERN F J, GANEAH S, et al. Tissue levels of matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 are related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer, 1996,74(3):413417.

[7]PENNISI E. New tumor suppressor foundtwice[J]. Science, 1997,275(5308):18761878.

[8]刘伟,于文成,时衍同,等. PTEN在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J]. 齐鲁医学杂志， 2005,20(3)：217221.

[9]LEVINE R A, FOREST T, SMITH C. Tumor suppressor PTEN is mutated in canine osteosarcoma cell lines and tumors[J]. Vet Pathol, 2002,39:372378.

[10]FURUKAWA K, KUMON Y, HARADA H, et al. PTEN gene transferr suppresses the invasive potentiall of human malignant gliomas by regulating cell invasionrelated molecules[J]. Int J Oncol, 2006,29(1):7381.

[11]TAO J, XIONG J, LI T, et al. Correlation between protein expression of PTEN in human pancreatic cancer and the proliferation infiltration, metastasis and prognosis [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2006,26(4):444447.