胃腺癌蛋白质组双向电泳技术的建立
发表时间：2009-09-27 浏览次数：540次
胃腺癌蛋白质组双向电泳技术的建立作者：刘国红 刘书漫 呼琳 张钦宪 作者单位：450052 郑州大学基础医学院 【关键词】 蛋白质组学 双向电泳 胃癌 a：60 μg; b：130 μg;c：200 μg 图1 胃癌组织双向电泳图谱（略）Fig 1 Two²dimensional electrophoresis map of gastric cancer0 引言 随着蛋白质组概念的提出及其相关技术的迅猛发展，使人们从蛋白质组整体水平研究胃癌成为可能。而双向电泳技术是蛋白质组学研究的首要条件和关键技术。本实验以胃腺癌组织为研究对象，对双向电泳的程序及有关环节，进行一系列改进和优化，目的是提高分辨率和重复性，获得理想的电泳图谱，为后续研究奠定基础。1 材料与方法 1.1 主要试剂和设备 17cm线性pH3～10 IPG胶条、pH3～10两性电解质、尿素、硫脲(Bio²Rad)；CHAPS、PMSF、DTT、碘乙酰铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、小牛血清白蛋白(Sigma)； PROTEIN IEF CELL 等电聚焦仪、PROTEAN Iixi cell电泳仪、GS²800图像获取仪、PDQuest7.1图像分析软件（Bio²Rad）。 1.2 方法 1.2.1 组织蛋白提取和定量 方法一：取胃癌组织100mg充分剪碎，移入玻璃匀浆器，加入1ml组织裂解液，于0℃冰水浴中匀浆，室温静置30min，转入1.5mlEP管，（方法二：再冰浴中150W、超声10s，间歇10s,共20次。）4℃ 20000r/min离心15min,取上清再离心30min,取上清即为组织总蛋白，BrandFord法[1]测蛋白浓度。分装后-80℃保存。 1.2.2 双向电泳 本实验采用17cm线性pH3～10 IPG胶条，同一胃癌蛋白样品，上样量分别为60、130、200μg，上样总体积400μl。第一向等电聚焦电泳（IEF）、胶条平衡、第二向垂直电泳（SDS²PAGE）具体步骤见Bio²Rad公司提供的操作指南。 1.2.3 2²DE凝胶银染、扫描和分析 凝胶经固定、敏化、银染、显色等步骤银染后，GS²800图像获取仪扫描图像，PDQuest7.1软件分析。2 结果 2.1 蛋白定量结果 方法一提取的蛋白浓度为（11.3±0.2） μg/μl ,方法二提取的蛋白浓度为（14.5±0.7） μg/μl。方法二效果较好。 2.2 不同蛋白上样量的2²DE图谱 同一胃癌蛋白样品，上样量分别为60、130、200 μg，经双向电泳、凝胶图像分析，蛋白质斑点检测结果分别为423、859和927，见图1。上样量60 μg，蛋白质斑点稀疏， 130 μg上样量则蛋白质斑点明显增多，而上样量200 μg时，高丰度蛋白斑点过大，交叉重叠，纵横条纹增多，反而掩盖了其他低丰度蛋白的显示。3 讨论 为了获得高分辨率和高重复性的2²DE图谱，样品制备十分关键，因此组织裂解液配方和裂解方法的选择显得尤其重要。组织裂解液成分包括尿素、硫脲、DTT、CHAPS和PMSF等，尿素和硫脲合用增强了样品溶解性，PMSF为蛋白酶抑制剂，但PMSF在还原剂DTT存在时失效，所以我们在组织匀浆时先加入PMSF研磨数分钟后再加DTT，保证蛋白酶抑制剂的效应。CHAPS是目前应用最广泛的表面活性剂，对疏水蛋白的促溶能力很强[2]。考虑到裂解液中的两性电解质可以和核酸结合，并在随后的超速离心形成沉淀而除去[3]，同时核酸还可通过超声破碎后超速离心去除[4]，因此裂解液中没有专门加核酸酶。组织样品裂解方法有研磨法、机械匀浆法、超声裂解法等，考虑到胃癌组织间质成分多，质地坚韧，不易研碎，本实验选择了剪碎组织成糊状，加入裂解液匀浆，之后再超声破碎联合应用，大大提高了蛋白提取效果。 蛋白质样品的上样量大小也是影响凝胶图谱的重要环节，不同长度不同pH范围的胶条、染色方法、凝胶是分析型还是制备型或者转膜凝胶，蛋白上样量都有所不同。提高上样量，利于更多低丰度蛋白点检出，但高丰度蛋白斑点过大、交叉重叠，又会掩盖其他蛋白点分离。蛋白上样量太少，容易造成某些蛋白点模糊甚至缺失，选择一个合适的上样量非常重要。本实验准备采用银染法分析凝胶，17cm pH3～10,L,IPG胶条银染法蛋白上样量范围在50～375 μg，我们选定三个上样量比较分离效果，发现130 μg上样量效果最好，因此后续研究准备选择130 μg上样量。 等电聚焦过程中聚焦电压是影响蛋白分离效果的另一重要因素，实验发现，17cm胶条聚焦电压最少要达到4000V以上，等电聚焦效果才有可能较好。蛋白样品的纯度、上样量大小、以及样品含盐离子多少都会影响等电聚焦的电压。本实验发现多步除盐，延长除盐时间有助于聚焦电压的上升。 总之，通过实验摸索，我们对组织裂解液配方，样品处理方法、上样量大小和电泳参数设置进行了一系列改进和优化，建立了一套适合胃腺癌蛋白质组分析的双向电泳技术，为后续的胃癌蛋白质组研究提供了良好的技术支持和保障。【参考文献】 ［1］ kruger N J.The BradFord method for protein quantitation［J］.Methods MolBiol,1994,32(1):9²15. [2] 廖翔，应天翼，黄留玉，等.蛋白质组学研究中的双向电泳技术［J］. 生物技术通讯，2003，14（6）：522²524. [3] 贺量，冷波，陈清西，等.胃癌细胞SGC²7901双向电泳技术系统的建立和优化［J］.厦门大学学报（自然科学版），2006，45（增刊）：149²151. [4] 周成林，王继生， 李惠芝，等.大鼠脑组织蛋白质双向电泳技术的建立［J］. 重庆医科大学学报， 2006，31（6）：794²797.
