杉醇脂质体的体内外抗肿瘤作用研究
发表时间：2009-08-10 浏览次数：641次
作者：杨爱珍 李军 徐海军 陈惠英 作者单位：1.解放军第81医院全军肿瘤中心，江苏 南京 210002；2.南京医科大学基础医学院机能学实验室，江苏 南京 210009
【摘要】［目的］ 研究注射用紫杉醇脂质体的体外细胞毒作用和体内抗瘤作用及药物毒性。［方法］ 用MTT法检测紫杉醇脂质体对人肺腺癌细胞株SPC-A1的体外杀伤作用；建立小鼠实体型S180肿瘤模型，共50只，随机分为5组：5%葡萄糖溶液组（空白对照组）、紫杉醇注射液10mg/kg组和15mg/kg组，紫杉醇脂质体10mg/kg组和15mg/kg组，观察各组抑瘤作用和小鼠一般状态的变化，并检测肝功能和骨髓像改变。［结果］ 紫杉醇脂质体对体外培养的人肺腺癌细胞株SPC-A1在浓度为2.5ng/ml、5.0ng/ml和10.0ng/ml时,其抑制率分别为39.1%、51.9%和55.8%。体内给予紫杉醇脂质体10mg/(kg·d)，15mg/(kg·d)3d，对小鼠S180实体型的抑瘤率分别为31.12%和45.29%，与同样剂量紫杉醇注射液组比较无显著性差异；给药后动物行为和小鼠体重变化率较紫杉醇注射液组接近对照组；骨髓抑制程度亦低于同剂量紫杉醇注射液组。［结论］ 相同给药剂量下，紫杉醇脂质体的体内外抗肿瘤活性与紫杉醇注射液相接近，但药物毒副反应明显降低。
【关键词】 紫杉醇 脂质体 人肺腺癌细胞株 小鼠移植性肿瘤 抗肿瘤作用
A Study on Antitumor Effect of Liposome Encapsulated Paclitaxel in Vivo and in Vitro
YANG Ai-zhen1, LI Jun2, XU Hai-jun1, et al.(1.PLA Cancer Center, the 81st Hospital, Nanjing 210002, China；2.Lab of Function, School of Basic Medical Science, Nanjing Medical University, Nanjing 210002, China)Abstract: ［Purpose］ To study the cytotoxic effect of paclitaxel liposome for injection in vitro, as well as to observe the antitumor activity and toxicity in vivo. ［Methods］ The cytotoxic effect of paclitaxel liposome on human lung adenocarcinoma cell line SPC-A1 in vitro was detected by thiazolyl blue(MTT) assay. The model of mice solid S180 sarcoma was established and 50 mice were divided into 5 groups: 5% glucose solution group (control group), 10mg/kg and 15mg/kg paclitaxel injection groups, 10mg/kg and 15mg/kg paclitaxel liposome groups. The antitumor activity of each group and general condition of mice were observed, the myelogram and the hepatic function index of S180 mice were detected. ［Results］ The inhibitory rate of paclitaxel liposome on human lung adenocarcinoma cell line SPC-A1 was 39.1%，51.9% and 55.8% at the concentrations of 2.5ng/ml, 5.0ng/ml and 10.0ng/ml, respectively. Under the doses of 10mg/(kg·d),15mg/(kg·d) for 3 days,the inhibitory rate of paclitaxel liposome against xenograft of solid S180 tumor in mice was 31.12% and 45.29%, and there were no significant difference among those of the paclitaxel injection groups. Comparing with the paclitaxel injection groups, the animal behavior and mice weight variable rate of paclitaxel liposome groups were similar to the control group, and less myelosuppression. ［Conclusion］ It suggests that paclitaxel liposome possessed the same anti-tumor activities in vitro and in vivo but its toxicity is lower than that of paclitaxel injection under the same dosage.
Key words: paclitaxel; liposome; human lung adenocarcinoma cell; mice transplant tumor; anti-tumor effect
由于紫杉醇不溶于水及多种药用溶媒，目前市售紫杉醇注射液均采用由聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇组成的混合溶媒，而聚氧乙基代蓖麻油对人体具有多种毒性并引发部分病人严重过敏反应，因而使紫杉醇注射液的应用受到了限制[1]。脂质体是一种新的药物载体，它具有改善药物的溶解性，延长药物的半衰期，提高药物靶向性和降低药物毒副反应等优点[2]。注射用紫杉醇脂质体（力扑素），采用脂质体这一药物新载体，解决了紫杉醇不溶于水的难题，不再使用聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇的混合溶媒，从而避免了因其引起的人体毒性反应和过敏反应。本文研究比较了注射用紫杉醇脂质体和紫杉醇注射液的体内外抗肿瘤效果和相关毒副反应。
1 材料与方法
1.1 试验药物和试剂
注射用紫杉醇脂质体，南京思科药业有限公司生产，规格30mg/瓶，批号：050501；紫杉醇注射液，四川太极制药有限公司生产，规格30mg/瓶，批号：33050012。注射用紫杉醇脂质体用10ml 5%葡萄糖溶液稀释，置振荡器上振摇5min后使用。紫杉醇注射液用5%葡萄糖溶液稀释。RPMI1640为美国GIBCO公司产品，新生牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(MTT)为Fluka公司产品。
1.2 细胞株和实验动物
人肺腺癌细胞株SPC-A1引自中国科学院细胞所，S180瘤株引自中国药科大学，均在本科液氮长期冻存，用前复苏，SPC-A1细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液常规培养。S180瘤株在昆明种小鼠腹腔传代。昆明种小鼠由南京医科大学实验动物中心提供。
1.3 MTT法检测紫杉醇脂质体对SPC-A1细胞的
细胞毒作用
将对数生长期的SPC-A1细胞以5×104个/ml、100μl/孔接种于40孔培养板中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，培养24h后分别将药物配成3个级别成倍比稀释浓度梯度(用1640培养液稀释)，每一浓度的化疗药物设4个平行孔，每孔加入药液100μl，另设无药对照组，继续培养96h后，加入5.0mg/ml MTT 20μl，再培养4h，弃培养上清，每孔加100μl 0.04mol/L盐酸异丙醇，振荡溶解结晶，用酶标仪检测570nm处的吸光度值，计算细胞抑制率。相对抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。
1.4 S180小鼠移植瘤模型的建立及实验分组
用体重18g~22g的昆明种小鼠50只，每只小鼠前肢腋下注射0.2ml S180瘤株细胞悬液（2×107/ml），24h后按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。5组分别为5%葡萄糖溶液组（空白对照组），紫杉醇注射液10mg/kg和15mg/kg组，紫杉醇脂质体10mg/kg和15mg/kg组。各组给药途径均为尾静脉，给药体积均为0.2ml。各组于接种后1、3、5d分别给予5%葡萄糖注射液和相应剂量药物。每天观察小鼠的精神、活动状况，并于用药前和接种后第11d处死前称体重，经小鼠眼眶静脉丛取血，随即处死动物，解剖剥离肿瘤并称重，另取骨髓进行细胞分类检查，血样用于肝功能检测。根据以下公式计算抑瘤率：
肿瘤抑瘤率＝（1－给药组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%
1.5 统计学处理
检测数据以x±s表示，统计方法采用配对t检验。
2 结 果
2.1 注射用紫杉醇脂质体对SPC-A1细胞的生长抑制作用
由表1可见，在紫杉醇浓度为2.5ng/ml、5.0ng/ml及10.0ng/ml时培养96h，紫杉醇注射液对SPC-A1细胞的抑制率分别为32.5%、48.1%及51.9%，紫杉醇脂质体分别为39.0%、51.9%及55.8%。紫杉醇脂质体的抑制率略优于紫杉醇注射液，但两组间差异无显著性(P>0.05)。
2.2 动物给药后的反应
注射用紫杉醇脂质体给药后动物行为未出现异常，紫杉醇注射液给药后动物先出现短暂的兴奋，随后出现伏卧状，持续约10min。
2.3 注射用紫杉醇脂质体对小鼠实体型S180肉瘤的抑瘤作用
由表2可以看出在15mg/kg剂量组，紫杉醇脂质体和紫杉醇注射液具有相似的抑瘤作用，而在10mg/kg剂量组，紫杉醇脂质体的抑瘤作用略优于紫杉醇注射液，但无显著性差异(P>0.05)。
2.4 各组小鼠的肝功能及体重变化
本研究的两个剂量，两种剂型的紫杉醇对小鼠肝功能均无明显影响，但从动物体重变化可以看出，紫杉醇脂质体组给药前后动物体重增长较紫杉醇注射液组更接近空白对照组（见表3、4）。
2.5 各组小鼠的骨髓细胞分类检查结果
从表5可以看出，紫杉醇脂质体组因化疗导致的粒细胞系和红细胞系的抑制程度要轻于紫杉醇注射液组。
3 讨 论
紫杉醇是目前临床治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的最有效的药物之一，但因紫杉醇难溶于水，所以紫杉醇注射液都是以聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇组成混合溶媒制成的注射剂，为预防因上述溶媒引发的过敏反应及超过敏反应，临床上目前普遍采用大剂量激素加组织胺受体拮抗剂作为紫杉醇注射液使用前的常规预处理，即使如此仍然无法杜绝过敏反应和超过敏反应的发生[3]。此外，因使用预处理方案，限制了伴有糖尿病、高血压和溃疡病的肿瘤病人使用。注射用紫杉醇脂质体是以磷脂、胆固醇等为膜材料，采用特殊制备工艺将紫杉醇包裹在脂质体中，不再使用混合溶媒，避免了因使用混合溶媒而对人体所产生的毒副反应和临床使用的限制。
本研究结果表明：相同给药剂量下，注射用紫杉醇脂质体的体内外抗肿瘤效果与紫杉醇注射液相似，表明紫杉醇脂质体并未改变紫杉醇的化学结构，仍然保持了紫杉醇的抗肿瘤活性。体外试验紫杉醇脂质体对SPC-A1细胞的生长抑制作用略优于紫杉醇注射液，其原因可能与脂质体包裹药物后更容易进入细胞有关。
比较体内试验给药后动物行为，可以反映出不同剂型的紫杉醇药物给药后对动物机体反应的影响是不同的，紫杉醇脂质体的辅料是磷脂和胆固醇等材料，这些物质均为内源性物质，与机体的相容性好，因此紫杉醇脂质体给药后对小鼠无明显影响，动物行为表现与给药前相似；相比之下，因紫杉醇注射液的溶媒是聚氧乙基代蓖麻油和无水乙醇，前者对机体多个系统有毒性作用业已被研究证实[4]，而乙醇对机体的作用表现为随剂量由兴奋转为抑制，故紫杉醇注射液给药后小鼠表现与给药前相比就明显不同。
周卫等[5]研究了紫杉醇脂质体在大鼠体内的组织分布情况，发现紫杉醇脂质体在肝脏、肺、脾脏等组织中分布较多，考虑到紫杉醇脂质体可能造成的器官毒性，本研究比较了各组的主要肝功能指标，结果表明在本文所用的剂量下，紫杉醇脂质体组小鼠肝功能与对照组无显著性差异，与紫杉醇注射液组之间也未发现显著性差异。紫杉醇脂质体在体内分布的改变并未增加其对肝脏的毒性，这与陈强等[6]进行的人体临床研究结果基本吻合。
给药前后的动物体重及骨髓像的变化提示，注射用紫杉醇脂质体的综合毒性要明显小于紫杉醇注射液，表现在治疗期间体重的变化及骨髓抑制程度减轻，紫杉醇脂质体组小鼠体重增加较紫杉醇注射液组快, 紫杉醇脂质体组因治疗导致的骨髓粒细胞系和红细胞系成熟过程的被抑制程度要轻于紫杉醇注射液组。
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[3] Kim SC, Kim DW, Shim YH, et al． In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation：toxicity and efficacy[J]． J Controlled Release, 2001, 72(1-3)：191-202．
[4] Cabanes A, Briggs KE, Cokhale PC, et al. Comparative in vivo studies with paclitaxel and liposome encapsulated paclitaxel[J]. Int J Oncol, 1998, 12(5):1035-1040.
[5] 周卫, 翁帼英, 陈文忠, 等. 紫杉醇脂质体在大鼠体内的组织分布[J]. 中国药学杂志, 2005, 40(9):1402-1404.
[6] 陈强, 张其忠, 刘健, 等. 紫杉醇脂质体与传统紫杉醇治疗乳腺癌和非小细胞肺癌的随机对照研究[J]． 中华肿瘤杂志, 2003, 25(2)：190-192．
