肿瘤的基因治疗研究进展

作者:周毅博,侯毅鞠

     【摘要】  随着分子生物学的发展，肿瘤基因治疗实验研究和临床应用都有了很大进步，这种治疗方法有望彻底治愈肿瘤。本文就肿瘤抑癌基因治疗、抑制肿瘤血管形成治疗、免疫基因治疗、自杀基因治疗四种策略，从其理论基础和相关实验研究进展进行了分析，并就肿瘤基因治疗的新途径、取得的主要成就、存在的问题及展望进行了综述。

   【关键词】  肿瘤；基因治疗

    肿瘤是危害人类生命最严重的疾病之一，传统治疗肿瘤的方法有手术、化疗、放疗等，这些方法虽然在临床上取得了一定的成就，但是很难彻底治愈肿瘤。近些年来，研究人员通过分析肿瘤的发因、发病及治疗过程，将彻底根治肿瘤的途径寄希望于基因治疗。所谓肿瘤的基因治疗(neoplasm gene therapy)就是用基因转移技术将正常或野生型(wild type)等外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正肿瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者通过增强宿主的免疫防御功能杀伤肿瘤细胞［1］。在肿瘤的基因治疗成为一种普遍的医疗手段之前必须有两个前提条件：一个是需要有清晰定义的靶组织，通常用肿瘤细胞作为进行基因治疗的细胞，靶组织的选择还必须考虑基因传递的效率、表达蛋白变性、机体免疫状态、可行性等因素；另一个是要往靶组织内传递多少治疗基因，传递基因的多少直接关系到实验的成败。

   1  抑癌基因治疗

    抑癌基因（tumor suppressor gene）又称抗癌基因（antioncogene）、隐形易感基因(tumor susceptibility gene)、隐形癌基因（recesive oncogene），指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。研究表明几乎一半人类肿瘤都存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因失活与肿瘤生长有着密切的关系，因此可将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞，去补偿和代替突变或缺失的抑癌基因、逆转肿瘤细胞的表型、抑制癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗的目的。抑癌基因主要包括p53、p63、 p73、 p16、pTEN、Rb等。

    野生型p53基因是目前研究最多的抑癌基因，具有强大的抑癌作用。有实验证明，直接在瘤体内注射携带野生型p53基因的重组腺病毒治疗头颈部鳞癌和非小细胞肺癌，结果肿瘤组织可表达p53基因，肿瘤坏死并凋亡［2］。如果p53基因突变，则突变p53对mdr1基因启动子有激活作用，造成mdr1的表达增强，从而增强肿瘤细胞多药耐药性，阻碍肿瘤治疗［3］。但有些特殊的突变型p53基因能抑制癌细胞的恶性转化，其蛋白产物也能抑制野生型p53基因的负性调节作用［4］。Vinyals等在将野生型p53引入p53突变的乳癌细胞系MDAMB468时发现，大部分细胞早期发生凋亡，有少数细胞生存并形成克隆［5］。Swisher在开展肺癌p53基因治疗的II期临床实验表明，p53基因的突变会增加肿瘤对放射治疗的抵抗力，腺病毒介导的p53基因转染会增强肿瘤的放射敏感性［6］。Roth等开展的直接瘤体注射携带野生型p53基因的重组腺病毒治疗头颈部鳞癌及NSCLC患者的I型临床研究的治疗结果表明：腺病毒成功地介导p53基因在肿瘤原位转染，绝大多数肿瘤组织可持续表达p53基因，瘤体内出现坏死和调亡，患者对于该疗法完全耐受，并有一定的疗效［7］。2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第一个基因治疗产品——重组人p53腺病毒注射液正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑［8］。

    此外，比较常见的抑癌基因还有：在结构上与p53基因具有相似性的p63基因，主要表达于鳞状上皮源性的恶性肿瘤，高表达的p63基因可抑制头颈部恶性肿瘤细胞的分化；p73基因是1997年由Kaghad发现，它在结构与功能上也与p53基因具有相似性，目前对p73基因的研究处于初步阶段，有较大争议，比如在喉鳞癌的研究中，提示p73基因并非喉癌癌变过程中的靶基因，而在鼻咽癌研究中提示其过度表达与喉鳞癌的进展、恶性程度及侵蚀性有关［9］；日本学者用携带野生型p16基因的复制缺陷型腺病毒（AxCAbp16）转染p16基因缺失的人胶质瘤细胞株U25MG，发现可显著抑制其在体内外生长；Sakurada等进行了pTEN基因治疗子宫内膜癌的实验研究，用pTEN重组腺病毒载体转染子宫内膜癌细胞，体外实验显示细胞生长被抑制、凋亡增强，在动物体内成瘤性被抑制［10］；Madreperla等以逆转录病毒为载体，将Rb基因导入鼠前视网膜母细胞瘤（RB）移植瘤中，肿瘤没有生长迹象［11］。

  2  抑制肿瘤血管形成治疗

    1971年哈佛大学医学院Folkman教授首先提出恶性肿瘤生长和转移依赖于肿瘤新生血管的观点，即肿瘤的生长必须依赖毛细血管获得足够的营养，进而生长、转移。因此，只要能抑制肿瘤毛细血管的生成，就能控制肿瘤的生长，使其萎缩、凋亡、坏死，最后被机体清除。我国第二军医大学南京军医学院徐根兴教授发现并利用“人体内皮抑素基因”形成了一种全新治疗肿瘤的方法。

    抗肿瘤血管生成基因治疗就是向肿瘤或靶细胞周围组织导入血管生成调节因子基因，通过改变肿瘤血管诱导因子和抑制因子之间的平衡来达到治疗肿瘤的目的。抑制血管生长的因子主要有血管内皮抑素(Endostatin)、白细胞介素(Interleukin12)、干扰素(INF)、血管抑制素(Angiostatin)等。Endostatin能抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，促进内皮细胞凋亡，进而抑制肿瘤的血管形成［12］。实验证明，血管内皮抑素对动物恶性肿瘤有强烈抑制作用，当给小鼠皮下注射内皮抑素0.3 mg/（kg·d）时，小鼠lewis肺癌的转移几乎完全被抑制［13］。在白血病动物模型中，内皮抑素对髓性白血病同样有抑制作用。组织病理检查显示，内皮抑素治疗Tnel纤维肉瘤后缩小的肿瘤部位新生血管明显减少，相关部位的肿瘤细胞大量凋亡。Yabushita等通过对57例I期子宫内膜癌患者的肿瘤组织进行分析，发现血管抑素阳性的患者生存期延长，且对子宫内膜癌患者的预后有重要提示作用［14］。Hampl等构建了编码血管生成抑制因子基因的腺病毒，腹膜内注射治疗经乳腺癌细胞株(TA3)、卵巢癌细胞株(Skov3和Es2 )诱导有腹膜癌转移的裸鼠，结果发现肿瘤血管形成减少，肿瘤缩小［15］。有报道称，美国内皮抑素Ⅰ期临床试验已完成，结果显示它对人体无毒，不产生耐药性，与其它药物合用或与放疗、化疗联合使用时效果更加显著。

　　3  肿瘤免疫基因治疗

    免疫基因治疗法是指利用基因进行免疫治疗，包括细胞因子基因治疗、制备DNA疫苗等。由于在肿瘤形成过程中机体免疫系统存在对瘤细胞的免疫耐受现象，而这种现象可能是由于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可能是由于抗原呈递细胞（APC）不能提供足够的刺激信号（B7），或者是机体免疫分子分泌不足等原因。Yoshida等构建了携带人干扰素β（IFNβ ）基因的腺相关病毒载体，干扰人胶质瘤细胞后可诱导瘤细胞凋亡和坏死，将此载体注入荷瘤鼠组织后可诱导肿瘤细胞产生热休克蛋白，抑制肿瘤生长，动物生存期显著延长［16］。Gansbacher等人将克隆IL2CDNA基因的病毒载体转染小鼠肿瘤细胞，输入小鼠体内后，这些肿瘤细胞除了自身失去体内成瘤能力，还抑制了体内野生型肿瘤细胞的生长。Han SK等用逆转录病毒作为载体，将人TNFacDNA转染给人肺癌细胞株，再将其经皮注射给裸鼠，发现其明显抑制肿瘤生长。

    目前肿瘤疫苗治疗也是一种新的研究方向，其中研究最多的是树突状细胞(DC)疫苗。DC细胞是体内功能最强、惟一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。围绕DC建立的旨在增强机体特异性抗肿瘤免疫能力的一系列策略，已成为肿瘤生物治疗的重要课题。目前，活化的树突状细胞已经成为某些肿瘤的有效治疗手段之一，已用于治疗淋巴瘤、乳腺癌、胃癌等，并取得了一定的成果。用B16黑色素或MCA106纤维肉瘤裂解物制备DC疫苗，免疫于肿瘤模型鼠，可使瘤鼠体内的肿瘤消失。Choudhury等利用多种细胞因子将急性粒细胞性白血病细胞诱导为DC，利于细胞免疫。Park等用自身同源单核细胞来源的DC细胞转导匙孔戚血蓝质抗原基因制成疫苗，接种与复发的妇科恶性肿瘤患者的肿瘤细胞，结果显示：这种疫苗耐受好并且安全，能增强抗原免疫原性并刺激应答，是妇科肿瘤治疗的有效手段［17］。DC与肿瘤细胞共同培养后，在培养上清液中可分离大量抗原小体，回输后可产生抗肿瘤免疫致肿瘤消退。目前，研制DC疫苗作为肿瘤生物治疗的方案已获美国食品药物管理局批准进入Ⅲ期临床，该疗法比传统LAK细胞疗法具有更特异、更强大的杀瘤活性，被誉为当前肿瘤生物治疗和基因治疗最有效的方法［18］。

  4  自杀基因治疗

    自杀基因治疗的一个显著特点是产生“旁观者效应”（bystander effect，BE），即不仅杀死已经转染的肿瘤细胞，而且可引起临近未转染的肿瘤细胞死亡，其机制是通过细胞间的缝隙连接将毒性代谢产物从转染的肿瘤细胞中转移到相临的肿瘤细胞或者通过血管凋亡抑制肿瘤生长。研究最多的自杀基因/前药系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）/丙氧鸟苷（GCV）。HSVTK 能催化GCV磷酸化，其磷酸化产物能阻止DNA合成，对分离期瘤细胞产生杀伤作用［19］。Hayashi等以逆转录病毒作为载体将HSVTK基因导入Y79RB细胞，体外实验观察到，Y79TK细胞对GCV的敏感性较亲代提高，同时观察到了旁观者效应的存在；体内实验时，HSVTK/GCV系统基因治疗组裸鼠皮下接种部位无肿瘤生长［20］。Burrows等将HSVTK基因导入人和鼠的神经胶质细胞株，给予GCV后，发现二者均有较强的旁杀伤效应，当培养液中仅5%的肿瘤细胞转染时，却有90%以上的肿瘤细胞死亡。Zager等用HSVTK通过病毒转染治疗肝癌荷瘤小鼠，在大剂量TK治疗下，小鼠肿瘤负荷明显减少［21］。ChevezBarrios等曾报告，选取双眼RB，应用HSVTK/GCV系统基因治疗后，所有患者均获得临床效果，其中一名患者治疗后，监测27个月未查及肿瘤生长，所有患者未出现肿瘤经眼部注射球外蔓延［22］。另外，有的学者提出了一种远程旁观者效应的说法。Pierrefite等用大肠埃希菌胞嘧啶氨酶（cytosine deaminase，CD）基因修饰的肿瘤细胞给小鼠结肠癌转移模型予皮下及肝内注射，再予咪康唑加5氟胞嘧啶（5Fc）治疗，发现70%的肿瘤细胞消亡，且阻止了肿瘤的扩散，提出了“自杀细胞疫苗”的概念，尤其是皮下注射了自杀细胞疫苗后结肠癌细胞消退及扩散的停止，支持了“远程旁观者效应”［23］。

    5  存在的问题及展望

    肿瘤基因治疗目前还处于发展早期，虽然在动物实验及临床I、II期实验中取得了较好的效果，但许多理想结果尚不能在人体上完全实现，其在临床实践中还面临许多困难。例如：怎样将治疗载体高效地转移到人体内、怎样确保载体的安全性、怎样更有效地减轻人体对重组载体的免疫作用、怎样选择更有效的目的基因及怎样有效地将基因治疗与其它治疗方法联合应用等，都是目前基因治疗实践中所遇到的难题。

    肿瘤的基因治疗是人类从分子水平对肿瘤进行治疗，也是人类不断探索不断研究和科学技术日益发达的结果。从某些方面它还处于初级探索阶段，虽然在理论上相对成熟，但在临床实际应用还有一定的难度。今后努力的方向有以下几方面：进一步认清机体抗肿瘤机制，寻找新的治疗途径；发现更有效的载体，进一步提高目的基因的表达效率；多基因联合治疗，可克服单基因治疗时局部浓度不高，作用时间不长等缺点。我们相信随着人类基因组计划的实施和分子生物学技术的发展，肿瘤的基因治疗会取得更大的成就，更好的为人类服务。

【参考文献】  ［1］ 字应伟.肿瘤基因治疗研究进展［J］.思茅师范高等专科学校校报,2005,21(3):68.

［2］ Willis A C,Chen X.The promise and obstacle of p53 as a cancer therapeutic agent［J］.Curr Mol Med,2002,2(4):329345.

［3］ 范凯,王辉,于志红,等.X射线照射诱导鼻咽癌细胞mdr1和p53基因的表达及临床意义［J］.中国肿瘤临床,2006,33(5):260263.

［4］ Haupt S,Berger M,Goldberg Z,et al.Apoptosis－the p53 network［J］.J cell sci,2003,116(20):40774085.

［5］ 吴焱,傅松滨.肿瘤抑制基因在恶性肿瘤基因治疗中的应用［J］.国外医学:遗传学分册,2001,24（1）:1721.

［6］ Swisher S G,Roth J A,Komaki R,et al.Induction of p53regulated genes and tumor regression in lung cancer patients after intratumoral delivery of adenoviral p53 (INGN 201) and radiation therapyt［J］.Clin Cancer Res,2003,9(1):93101.

［7］ 张小伟.恶性肿瘤的抑癌基因治疗研究进展［J］.眼科研究,2000,18(5):463466.

［8］ 杨家驹,段振铃.肿瘤的基因治疗进展［J］.医学综述,2005,11(10):883885.

［9］ 贾海英.p53家族新成员p63、p73与头颈部肿瘤［J］.中国耳鼻喉颅底外科杂志,2005,11(4):285287.

［10］ Sakurada A,Hamada H,Fukushige S,et al.Adenovirusmediated delivery of the PTEN gene inhibits cell growth by induction of apoptosis in endometrial cancer［J］.Int J Oncol,1999,15(6):10691074．

［11］ Madreperla S A,WhittumHudson J A,Prendergast R A,et al.Intraocular tumor suppression of retinoblastoma genereconstituted retinoblastoma cells［J］.Cancer Res,1991,51(23Pt1):63816384．

［12］ 冯玉梅.内皮抑素在新生血管形成相关疾病中的作用机制研究进展［J］.生物技术通讯,2005,16(3):323325.

［13］ 宋磊,刘红军,崔进梅.抗肿瘤新药血管内皮抑素的研究进展［J］.齐鲁药事,2005,24(3):162163.

［14］ Yabushita H,Noguchi M,Kinoshita S,et al.Angiostatin expression in endometrial cancer［J］.Oncol Rep,2002,9(6):11931196.

［15］ Hampl M,Tanaka T,Albert P S,et al.Therapeutic effects of viral vectormediated antiangiogenic gene transfer in malignant ascites［J］.Hum Gene Ther,2001,12(14):17131729.

［16］ Yoshida J,Mizuno M,Nakahara N,et al.Antitumor effect of an adenoassociated virus vector containing the human interferonbeta gene on experimental intracranial human glioma［J］.Jpn J Cancer Res,2002,93(2):223228．

［17］ Park T,Hemando K,Kubler T,et al.A phase 1 study of vaccination with tumor cells in patients with advanced gynecological cancers［J］.Thirtyseventh Annual Meeting:American Society of Clinical Onoology,2001,1074:269a.

［18］ 宋海珠,罗荣城,姜波.肿瘤基因治疗的研究进展及展望［J］.解放军医学杂志,2002,27(7):651652.

［19］ Tanaka T,Yamasaki H,Mesnil M.Induction of a bystander effect in Hela cells by using a bigenic vector carrying viral thymidine kinase and connexin32 genes［J］.Mol Carcinog,2001,30(3):176180.

［20］ Hayashi N,Ido E,Obtsuki Y,et al.An experimental application of gene therapy for human retinoblastoma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40(2):265272.

［21］ Burrows F J,Gore M,Smiley W R,et al.Purified herpes simplex virus thymidine kinase retroviral particles:III.Characterization of bystander killing mechanisms in transfected tumor cells［J］.Cancer Gene Ther.2002,9(1):8795.

［22］ ChevezBarrios P,Chintagumpala M,Mieler W,et al.Response of retinoblastoma with vitreous tumor seeding to adenovirusmediated delivery of thymidine kinase followed by ganciclovir［J］.J Clin Oncol,2005,23(31):79277935.

［23］ PierrefiteCarle V,Baque P,Gavelli A,et al.Subcutaneous or intrahepatic injection of suicide gene modified tumour cells induces a systemic antitumour response in a metastatic model of colon carcinoma in rats［J］.Gut,2002,50(3):387391.