激光共聚焦显微镜观察人胃癌细胞的粘附过程和整合素β1的表达

作者单位：宁夏医学院病理教研室，宁夏 宁川 750004     【摘要】  ［目的］ 探讨胃癌细胞粘附过程中的形态学变化以及与整合素β1表达的关系。［方法］ 借助位相差显微镜和激光共聚焦显微镜对胃癌MKN1活体细胞的粘附过程和整合素β1的表达部位和程度进行观察。［结果］ 细胞通过伸出伪足附着在培养盘上，整合素β1在细胞膜和细胞伪足部分的表达增强，并形成集落团块。［结论］ 人胃癌MKN1细胞的粘附过程和整合素β1的表达有直接关系。

   【关键词】  胃肿瘤 粘附 整合素β1

    粘附是肿瘤细胞转移的一个基本过程。整合素是一个质膜糖蛋白的家族，由非共价结合的杂合二聚体组成，参与细胞—间质及细胞—细胞间粘附作用，包括胚胎发育、止血、血栓形成、创伤愈合、免疫性及非免疫性防御机制和致癌的转化作用等。整合素β1与肿瘤浸润有关。本实验使用共聚焦显微镜对胃癌MKN1细胞的粘附过程进行了观察，同时对整合素β1在粘附过程中的作用进行了研究。

    1   材料与方法

    1.1   主要材料

    人胃癌MKN1细胞株购自日本癌研究资源库。细胞保存在含有10%小牛血清(FBS)的RPMI?鄄1640培养液中，在37℃，5%CO2的条件下培养。使用FITC标记的抗整合素β1抗体。

    1.2   方   法

    位相差显微镜观察：将MKN1细胞(5×104细胞/孔) 培养于4孔培养盘中30min后用位相差显微镜观察细胞的形态。

    细胞整合素β1的荧光免疫染色：将MKN1细胞培养于含有FITC标记的抗整合素β1抗体（1/50）的0.2% 牛血清蛋白（BSA）/PBA中90min。用PBS洗3次后，将细胞置于共聚焦显微镜观察盒中，用含有10%FBS的培养液培养,在37℃，5%CO2条件下进行观察（激发波长488nm，发射波长515nm）。

    2   结   果

    2.1   胃癌MKN1细胞形态变化

    胃癌MKN1细胞是贴壁生长细胞，在置入培养盘后很快附着在培养盘壁上，并粘附于培养盘上。细胞首先发生形态变化，由圆形变成椭圆形，同时伸出伪足与培养盘壁相接，使细胞稳定地粘附于培养盘壁上。细胞继续伸展成扁平状，并通过伪足与其它细胞接触形成单细胞层，这种结构可以使细胞稳定附着于培养盘上。培养30mim后位相差显微镜下即可观察到细胞与培养盘粘附；4h后可观察到细胞伸展呈扁平状，表面形成伪足，细胞伪足间相互连接，使细胞稳定附着于培养盘上。

    2.2   整合素β1

    整合素β1为跨膜蛋白，在细胞膜上表达。培养5min后即可观察到细胞表面形成毛刺状伪足(图1箭头所示)，在细胞膜上可观察到较弱的荧光信号，即整合素β1有微弱表达。培养2h后细胞变形并形成伪足，在细胞底面的细胞膜上和毛刺状伪足上可以观察到较强的荧光信号，表明整合素β1向细胞底面和细胞伪足聚集。培养4h后，细胞底面形成巨大伪足，在细胞伪足上可观察到强烈的荧光信号，整合素β1形成许多巨大的集落团块见图2。

    3   讨   论

    整合素是一种膜镶嵌糖蛋白，由18ix和813两个亚单位非共价形成异二聚体复合物。亚单位的变异使整合素形成一个庞大的家族，有的参与不同细胞之间的粘附连接，有的协助细胞和细胞外基质的结合。整合素通过胞外区与配体细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)结合，如纤黏连蛋白(fibronectin，FN)，玻黏蛋白(vitronectin，VN)等，个别的还能与可溶性的配体如纤维蛋白原(fibrinogen)和一些细胞表面分子结合，从而介导细胞与ECM 以及细胞与细胞之间的粘附[1]。它通过胞内区与细胞内的骨架蛋白、肌动蛋白、辅肌动蛋白、踝蛋白、纽蛋白等相互作用[3]。细胞经整合素介导与ECM粘附并在其上铺展，整合素在粘附面的分布呈斑点存在，细胞骨架蛋白以斑点为中心集中，在细胞膜的胞质面形成黏附斑[2]。由此，整合素将细胞外基质与细胞内骨架蛋白连接在一起，介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质的粘附，维持细胞的形态，影响细胞的粘附、运动、吞噬等作用[3]。

    肿瘤转移是一个复杂的多步骤多环节的过程，在肿瘤转移过程中发生许多肿瘤细胞和ECM的相互作用，整合素在此过程中发挥主要作用。当癌细胞发生转移时，它们与ECM的亲和力发生改变，这种表型改变通过细胞表面黏附分子整合素的改变、蛋白酶释放使ECM重塑及新的ECM分子沉积来调节[4]。这些激活的信号级联调节基因的表达、细胞骨架的形成、细胞粘附和细胞存活，结果使癌细胞更具侵袭性，在不同微环境中更好地生存[5]。在转移过程中，癌细胞伸出扁平伪足与ECM粘附，同时使ECM分子之间的联系消失，从而使癌细胞前行。

    本研究通过光学显微镜和共聚焦显微镜观察到MKN1细胞移动时首先伸出伪足，然后细胞变形成为扁平状，细胞与细胞之间以伪足相连接，细胞通过其形态改变以及与其它细胞间的连接达到稳定状态，从而牢固地附着于培养盘上。伪足的作用如同探测器，与周围细胞或细胞外间质接触后引导细胞着陆[6]。一些关于整合素集落的形成和转移的研究表明，在细胞活动中，活性化的整合素通过局部聚集的方式从细胞的后缘（尾部）转移到细胞的前方（头部），并在此与细胞外结构形成粘附接触，引发细胞局部粘附的形成[7]。整合素是位于细胞膜上的跨膜蛋白，当整合素细胞外结构与细胞外间质、糖蛋白、补体以及其他细胞相互作用使整合素受到激活后，整合素通过踝蛋白和钮蛋白使细胞肌动蛋白和微丝的结构发生变化，导致细胞骨架的重组，以及细胞形态的改变。

    MKN1细胞形态学变化与整合素表达的增强之间的关系表明整合素β１的表达与胃癌MKN1细胞的粘附过程有直接关系，调节整合素β１的表达有可能影响胃癌MKN1细胞的粘附，即影响胃癌细胞的转移。

【参考文献】[1] Hegerfeldt Y, Tusch M, Brocker EB. Collective cell movement in primary melanoma explants: plasticity of cell?鄄cell interaction, beta1?鄄integrin function, and migration strategies[J]. Cancer Res, 2002, 62(7):2125-2130.

[2] Podar K, Tai YT, Lin BK, et al. Vascular endothelial growth factor?鄄induced migration of multiple myeloma cells is associated with beta 1 integrin?鄄and phosphatidylinositol 3?鄄kinase?鄄dependent PKC alpha activation[J]. J Biol Chem, 2002, 277(10):7875-7881.

[3] Brakebusch C, Fassler R. Beta 1 integrin function in vivo: adhesion, migrate and more[J]. Cancer Metastasis Rev, 2005, 24(3):403-411.

[4] Takahashi K. The linkage between beta1 integrin and the actin cytoskeleton is differentially regulated by tyrosine and serine/threonine phosphorylation of beta1 integrin in normal and cancerous human breast cells[J]. BMC Cell Biol, 2001, 2:23.

[5] Goel HL, Moro L, King M, et al. Beta1 integrins modulate cell adhesion by regulating insulin?鄄like growth factor?鄄Ⅱ levels in the microenvironment[J]. Cancer Res, 2006, 66(1):331-342.

[6] Zhang W, Alt?鄄Holland A, Margulis A, et al. E?鄄cadherin loss promotes the initiation of squamous cell carcinoma invasion through modulation of integrin?鄄mediated adhesion[J]. J Cell Sci, 2006, 119(Pt 2):283-291.

[7] Giancotti FG, Ruoslahli E. Integrin signaling[J]. Science, 1999, 285（5430）:1028-1032.