苯丁酸钠体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
发表时间：2009-06-08 浏览次数：784次
作者单位：山东省立医院，山东 济南 250021 【摘要】 ［目的］ 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。［方法］不同浓度苯丁酸钠处理HepG2，应用MTT比色法观察苯丁酸钠对HepG2的生长抑制作用，落射荧光显微镜、DNA电泳和流式细胞仪观察HepG2的凋亡，Western blot检测苯丁酸钠处理前后HepG2细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化。［结果］ 苯丁酸钠2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L作用48h对细胞的抑制率分别为19.41%、39.03%、42.19%，作用72h对细胞的抑制率分别为27.42%、57.11%、70.31%，并诱导细胞凋亡；4mmol/L苯丁酸钠作用HepG2 48h细胞凋亡率明显高于对照组。落射荧光显微镜和DNA电泳均观察到苯丁酸钠作用后HepG2细胞出现凋亡细胞的特征性变化。苯丁酸钠处理HepG2后Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加。［结论］ 苯丁酸钠体外抑制HepG2增殖并促进其凋亡，其作用机制可能是通过降低细胞内的Bcl-2蛋白，增加细胞内Bax蛋白而实现的。
【关键词】 肝肿瘤
近年来越来越多的研究资料表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）对白血病、淋巴瘤以及多种实体瘤具有诱导分化和治疗作用[1~4]，同时作为一种诱导分化恶性肿瘤的新药，苯丁酸钠具有广谱、高效、低毒的特性[5]。我们在实验中观察了苯丁酸钠对人肝癌细胞HepG2的作用，探讨苯丁酸钠对HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。
1 材料与方法
1．1 细胞培养
HepG2细胞购自山东省医学科学院细胞室。培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司产品），置于37°C 5%CO2的孵箱内培养。48h传代，0.25%的胰酶、 0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）消化。取对数生长期的细胞进行实验。
1．2 药 物
苯丁酸钠购自ALEXIS，用RPMI1640培养基溶解为20mmol/L浓度备用。
1．3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验
将HepG2细胞悬液浓度调整为5×104/ml，每孔200μl接种于96孔板，实验组分别加入不同浓度的苯丁酸钠，对照组不加药，另设空白对照孔（只加培养基，无细胞），每组设三个平行重复孔。继续培养，分别在48h、72h各取三孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置孵箱内4h后弃上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸钠）200μl，过夜。震荡15min，用全自动酶标仪（Denley Drangon Wellscan MK2）检测570nm处的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。
1．4 荧光染色观察细胞凋亡
常规收集对照组、苯丁酸钠处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次。加入荧光染料Hoechst33342（Anaspec产品）至终浓度为2.5μg/ml，37℃避光孵育染色30min，取细胞悬液滴于清洁的载玻片，盖上盖玻片，落射荧光显微镜（JEOL-1200EX型）下观察细胞。
1．5 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡
对数生长期的细胞用无血清的RPMI1640培养24h同步化后，分组干预48h。收集不同处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl细胞悬液与含1%RNA酶的Tis-HCl缓冲液混匀共同孵育10min，加入碘化丙啶（PI）和异硫氰酸荧光素（flucresceinisothiocyanate，FITC）标记的磷脂酰结合蛋白（AnnexinV）各5μl混匀，避光37℃孵育30min，FCM（FACScan美国BD公司产品）检测，凋亡细胞AnnexinV-FITC（+）PI（-），正常活细胞AnnexinV-FITC（-）PI（-），坏死细胞AnnexinV-FITC（+）PI（+），利用Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。
1．6 DNA电泳
收集对照组，苯丁酸钠处理组细胞各5×107，4℃PBS洗涤2次，采用常规的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法。提取出的DNA用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色AlphalmagerTM 2200数字电泳凝胶成像系统成像分析。
1．7 Western印记法检测Bcl-2、Bax表达蛋白
收集约5×107的细胞，PBS洗涤2次，细胞裂解液（50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1g/L SDS，1mM DTT，10ml/L Np-40，10g/L脱氧胆酸钠，25mg/L亮抑素，25mg/L胰蛋白酶抑制剂，1mM PMSF）提取细胞总蛋白。蛋白定量采用BCA法。调节每份样品浓度，加入等体积2×SDS加样缓冲液，煮沸5min。每孔加样20μg蛋白质，经SDS-PAGE电泳后转膜，与鼠抗人Bcl-2（C-2）、鼠抗人Bax(N-20)单克隆抗体37℃温育2h，4℃过夜。与碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG 37℃温育1h，加入ECL化学发光试剂，暗室显色1min，X线片曝光，利用AlphalmagerTM 2200图像处理软件对结果进行辉度扫描，计算电泳条带的积分吸光值。以上抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色剂由武汉博士德公司提供。
1．8 统计学处理
每次实验至少重复3次，计量数据以x±s表示，统计学分析采用SPSS软件进行one-way ANOVA和Student t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2．1 苯丁酸钠对细胞生长的抑制作用
苯丁酸钠明显抑制HepG2细胞的生长，见表1。
2．2 苯丁酸钠诱导HepG2凋亡
荧光染料Hoechst33342染色结果显示落射荧光显微镜下观察对照组HepG2细胞核染色均匀，绝大多数细胞核可见淡蓝色荧光，苯丁酸钠4mmol/L作用48h后HepG2细胞出现细胞核变小，染色质聚集呈不均匀块状并发出粉红色荧光，部分碎裂成凋亡小体。苯丁酸钠可诱导HepG2凋亡，见图1。
2．3 流式细胞仪检测细胞凋亡
对照组和处理组相比较，对照组早期凋亡的细胞24h、48h、72h分别为9.6%±1.5%、18.4%±2.3%、21.2%±2.6%，苯丁酸钠4mmol/L处理24h、48h、72h早期凋亡细胞分为37.2%±1.6%、48.3%±3.7%、56.8%±3.5%，各时间凋亡细胞比较差异均有显著性（P<0.05），提示苯丁酸钠可诱导HepG2凋亡（见图2）。分别提取苯丁酸钠4mmol/L处理48h、72h和对照组的细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳，苯丁酸钠处理组的细胞可见典型的DNA梯型条带，提示有细胞凋亡发生（见图3）。
2.4 Western印记法检测苯丁酸钠对HepG2中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
电泳条带的积分吸光值半定量分析：对照组Bcl-2为1.48±0.12，苯丁酸钠处理组Bcl-2为0.45±0.03（组间比较P<0.05），对照组Bax为0.20±0.10，苯丁酸钠处理组Bax为0.85±0.23（组间比较P<0.05）。苯丁酸钠4mmol/L作于HepG2 48h Western印记法检测Bax蛋白的表达增强，Bcl-2蛋白的表达降低。
3 讨 论
苯丁酸钠在临床上曾经被用于治疗尿素合成紊乱综合征，有研究发现苯丁酸钠可以抑制组蛋白去乙酰化酶，提高组蛋白的乙酰化水平，而调节组蛋白的乙酰化程度可以调控肿瘤细胞特定基因的转录水平[6~8]。
本研究结果表明苯丁酸钠对HepG2细胞有明显的的生长抑制作用，MTT结果显示苯丁酸钠的作用有时间和剂量效应关系（P<0.05）。经苯丁酸钠处理的细胞DNA凝胶电泳呈现典型的“梯形”条带，DNA荧光染色均观察到苯丁酸钠处理的细胞出现凋亡的特征性形态学改变，即细胞核染色质浓缩聚集于核膜，细胞膜表面伸出突起与细胞分离形成典型的凋亡小体。流式细胞仪分析显示经苯丁酸钠处理的HepG2早期凋亡率明显增加（P<0.05）。上述结果表明苯丁酸钠可以促进HepG2细胞凋亡的发生。进一步探讨苯丁酸钠诱导凋亡的作用途径，发现苯丁酸钠作用后引起Bcl-2表达减少，同时Bax表达增加，提示苯丁酸钠的作用机制可能是通过影响Bcl-2、Bax蛋白的表达实现。在细胞中Bcl-2与Bax的比例决定细胞的存活与凋亡。Bcl-2减少，同时增加的Bax又抑制了Bcl-2的活性，细胞色素C释放，活化了Caspase家族，从而启动细胞凋亡程序，使肿瘤细胞由稳态转向凋亡，抑制了肿瘤细胞的增殖[9]。有研究资料表明苯丁酸钠可以下调Bcl-2的表达，使肿瘤细胞发生周期阻滞同时有细胞凋亡增加[10，11]。本研究结果与此一致。从另外一个角度考虑：苯丁酸钠抑制了组蛋白去乙酰化酶的活性，Bcl-2、Bax蛋白自身的乙酰化修饰也有可能发生了变化，从而改变了蛋白的生物学效应。所以，Bcl-2、Bax的表达与组蛋白乙酰化的确切关系以及乙酰化对这两种重要基因和蛋白的调节和修饰机制有必要做进一步的探讨和证实。
肿瘤的诱导分化和凋亡是目前治疗肿瘤的重要研究方向，我们在研究中观察到苯丁酸钠对人肝癌细胞有明显的生长抑制和促进凋亡作用，为临床预防和治疗肝细胞癌提供了新的思路。
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