微阵列—比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用

作者单位：浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022

  【摘要】  微阵列比较基因组杂交(array-CGH) 技术是将DNA克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH法中中期染色体作为杂交靶，不仅使分辨率提高，甚至可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。全文综述Array-CGH的原理、方法及其在肿瘤学中的应用和意义。

  【关键词】  微阵列-比较基因组

    微阵列比较基因组杂交(array-comparative genomic hybridization，Array-CGH)技术是将DNA 克隆或cDNAs做成微阵列，代替传统CGH检测中将中期染色体作为杂交靶进行检测，不仅使分辨率提高，而且还可以确定肿瘤相关基因并提供精确的定位。同时可经计算机软件识别每条染色体，克服了需要经验丰富的人员识别染色体的限制，为快速全面地分析肿瘤组织DNA 拷贝数的变化，以及染色体不稳定性的检测提供了较为理想的方法。本文就该技术原理、方法及其在肿瘤研究中的应用作一简单的综述。

    1   微阵列—比较基因组杂交概述

    1.1   Array-CGH基本原理

    Array-CGH与CGH相似，但它是用DNA克隆或cDNAs微阵列代替中期染色体铺片作为杂交靶，即将等量的不同荧光标记的待测和参照DNA经人Cot-1DNA封闭非特异性重复序列后，同时杂交到由DNA克隆或cDNAs组成的微阵列上。用微阵列每个靶点上的两种信号的荧光比例反映待测基因组DNA在相应的序列或基因上的拷贝数变化[1～5]。

    1.2   方   法

    1.2.1   微阵列制备

    微阵列可以为DNA克隆微阵列和cDNAs微阵列。DNA克隆是在BAC、PAC 或YAC载体中克隆的DNA片段。cDNAs 微阵列，可以从样本中提取总 RNA，再分离mRNA，然后将得到的cDNAs进行PCR扩增。用专门的仪器将 DNA克隆或cDNAs点样至覆盖特定介质的玻片上，按照在染色体中的分布，确定靶点的排列顺序。为了得到精确的结果,每个靶点可重复点样2～10次。点样后，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存[1，2，4～7]。

    1.2.2   待测DNA和参照DNA制备及标记

    待测 DNA可以来自肿瘤细胞系、冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织。应尽可能选择具有典型组织学特征的肿瘤细胞，弃除坏死组织和炎症区及周边正常细胞，以免干扰。使用标准的酚—氯仿—异戊醇提取法分离肿瘤细胞和组织中的 DNA。对于甲醛固定、石蜡包埋组织,可以用激光捕获显微切割法（LCM）获得肿瘤组织，提取DNA，再用变性引物介导的PCR（DOP-PCR）扩增和标记[8]，参照 DNA来源于健康人血液中的白细胞或同一患者同一器官中正常组织。对探针可以进行直接或间接荧光标记。标记方法有以下几种：①缺口平移法；②随机引物法；③DOP-PCR法；④顺铂—荧光素连接法[1，9]等。标记完成后用SephadexG5旋转柱去除未结合的核苷酸[1]。

    1.2.3   杂   交

    将不同荧光标记的待测和参照DNA（各1μɡ）与人Cot-1（60μɡ）混合，封闭非特异重复序列，降低本底作用。然后将待测和参照DNA 80℃热变性10min。37℃孵育1～2h，再与已经预热的微阵列37℃杂交过夜，杂交后洗涤微阵列玻片，盖上盖玻片。对于DNA克隆微阵列，可以用DAPI复染，有助于定位靶克隆[1，2，4～8]。

    1.2.4   数据处理和图像分析

    用共聚焦扫描装置或带有冷光源相机的光学设备获取图像，并用专门的分析软件处理数据。需要确定实际的靶区域、靶信号强度和局部背景强度。从靶信号强度中扣除局部背景得到靶荧光比例。将正常标本在微阵列全部靶点的平均荧光比例调整为1，代表无DNA拷贝数变化。利用全部靶点的平均荧光比例（M）和标准差（s）确定拷贝数变化的界限。获得和缺失分别定义为＞（M+2s）和＜（M-2s），高水平扩增定义为＞（2M+2s）[7]。分析时去除在正常样本中荧光信号不知的点（荧光信号高出背景＜20％）和有过多荧光残骸的点[8]。DNA拷贝数图像可以用移动平均值（moving average）（5个相邻的靶）显示。移动平均值用于减少靶信号交叉引起的误差和降低背景[8，9]。

    1.3   可行性检测和质量控制

    Urban等[10]用已知有β-globin位点缺失的人用Array-CGH法进行检测验证Array-CGH检测染色体基因组缺失或扩增是否可靠，结果均检测到了缺失的存在，证明该芯片系统可以准确地检测基因或基因组的缺失。Veltman等[11]为用Array-CGH法检测膀胱肿瘤患者DNA拷贝数变化，为确定该技术及该芯片在检测基因或基因组改变的可信性，先用正常人对正常人的组织进行对比试验，结果没有缺失或扩增的信号出现。而在膀胱癌患者的组织中检测到了明显有扩增或缺失的信号发生。而这些缺失或扩增的部位，含有相应的癌基因或抑癌基因。证明此方法在检测基因扩增或缺失中，得出的结果是可信的。

    1.4   Array-CGH的特点

    Array-CGH技术具有两方面明显优势：①灵敏度和精确性：由于染色体DNA以高度密集和超螺旋的形式存在着，因此传统CGH只有在DNA序列缺失达10Mb～20Mb（细胞株）或20Mb～30Mb（原发肿瘤）以上或序列扩增时扩增子与扩增拷贝数之积至少2Mb才被检测出来。故传统CGH所提供的信息中必然包含有为数众多的基因，需要作进一步的精确定位。Array-CGH避开了复杂的染色体结构，所杂交的靶序列仅为包含了少数基因的短DNA片段，所以能找出传统CGH检测不出的DNA序列拷贝数的差异，并同时将扩增或缺失的范围精确地定位在某个或某几个已知基因或未知基因上。②自动化、程序化：染色体带型的复杂性和个体差异决定了核型分析不可能全部实现机械化，必须依靠经验丰富的细胞遗学家对核型分析软件得出的结果进行校正后才能进一步分析基因组的不平衡性。因此传统CGH的技术受人为因素的限制，需要一定的经验技术和劳动力支持。Array-CGH技术中不需要染色体核型的制备和分析，与普通的基因芯片检测表达谱的过程一样，其结果完全可以由机器和计算机综合分析后即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。

  1.5   Array-CGH技术的分类

    根据微阵列上所固化的核苷酸的性质，Array-CGH可分为cDNA Array-CGH和DNA Array-CGH两种类型。前者以常规的cDNA 微阵列为平台，基因芯片表面固定的探针来自待测种属的cDNA文库。cDNA Array-CGH技术使得大规模、高通量研究基因的改变成为现实。DNA Array-CGH技术是直接将基因组DNA片段固化于芯片表面，因此靶序列上不但有基因编码区，还包含了内含子、重复序列、其他调控序列等非翻译区，增加了实验结果的信息量。同时由于基因组DNA片段长于cDNA片段，因而DNA Array-CGH的杂交信号强于cDNA Array-CGH，提高了实验的敏感度。但cDNA Array-CGH芯片制备相对容易，而DNA Array-CGH芯片上广泛分布的表达序列标签也有助于所得序列进一步纯化和点阵。因此这两种Array-CGH技术各有所长，在实际工作中可根据具体情况和实验要求作出选择。

    2   Array-CGH技术在肿瘤研究中作用

    Array-CGH应用超高密度和长寡核苷酸探针，对多种肿瘤相关染色体区域的DNA拷贝数变化具有较高的分辨率，从而可以找出基因组的改变，并可精细到基因和外显子水平的改变；也可以检测到很小范围的基因扩增和缺失以及小于500碱基对的染色体断点位置。该技术最新进展，Nimblegene公司研制的芯片,在一芯片上含有385 000个探针，一次可以分析成千上万个基因组的变化，甚至可以确定相关基因并提供精确的定位[12~14]。

    2.1   乳腺癌

    应用Array-CGH技术，得到许多乳腺癌DNA拷贝数变化的图谱。Garcia等[15]应用Array-CGH在乳腺癌的研究中，不仅证实了传统CGH法探测到的8p11~12上的扩增和过表达区域与新发现FLJ14299，C8orf2， BRF2和RAB11FIP这四个基因密切相关，而且还认为这四个基因是最好候选“始动”癌基因。Varma等[16]应用Array-CGH研究不同地区及经受核辐射的乳腺癌患者基因拷贝数变化及基因表达水平，发现大量的以前没有被报道过的乳腺癌癌前病变的突变基因，并确定了用来鉴别来自核放射性微尘地区乳腺癌患者的基因拷贝数的变化图谱，发现共同扩增的基因在8p13.2、1p21.1、8q24.21，而在1p36.22、17p13.2、8p23.3基因有缺失。 浸润性导管癌和所有的浸润性小叶性癌大约80％的患者16q上都有部分基因缺失。共同的位点是在54.5~55.5Mb 和 57.4~58.8Mb。而丢失的峰值 (83%)却发生在61.9~62.9Mb[17]。Pole等[18]应用Array-CGH对48例乳腺癌患者及MDA-MB-134，MDA-MB-175，MDA-MB-361，T-47D和ZR-75-18p五个乳腺癌细胞系进行分析，发现均有8p远端丢失并在4Mb处有倒置，近端100kb丢失，而在NRG1和11q片段之间可以检测到3倍扩增。乳腺癌中相当部分的表现型独特性可能归因 DNA拷贝数的变化，广泛的DNA拷贝数的变化和伴随的基因表达的不平衡可能破坏了细胞代谢和生理情况下有决定性意义的化学平衡，促进染色体不稳定和肿瘤的发生、发展。Benetkiewicz[19]用Array-CGH法研究了取自60位妇女63个肿瘤的83份标本，总的来看表现为遗传改变的多样化，即有丢失，又有扩增，22q失衡的占22%(14/63)，这些改变定位在22q的端粒附近，大约220kb。

    2.2   肺   癌

    Cole等[20]利用Array-CGH技术分析了14例小细胞肺癌和27例非小细胞肺癌基因在各细胞周期调节中的作用，发现小细胞肺癌中MRP5基因表达增强，p38MAPK活化基因上调，而在非小细胞肺癌中表现为CDKN2A基因下调，MAPK9和EGFR基因上调。这些信息表明小细胞肺癌和非小细胞肺癌在细胞周期调控中有不同的基因调控机制。

    2.3   血液及淋巴系统肿瘤

    已有研究证明，人类染色体3p在许多实体瘤中有基因缺失情况发生，而没有数据表明它在弥漫大B细胞淋巴瘤中有基因缺失情况发生，Kameoka等[21]应用Array-CGH技术对弥漫大B细胞淋巴瘤进行研究时发现，大约30％的弥漫大B细胞淋巴瘤患者的基因在3p14.2上有缺失。所有这些基因缺失被确定在FHIT（Fragile Histidine Triad）基因片段内，并表明FHIT基因的缺失是引起基因突变的原因之一。van Vlierberghe等[22]利用Array-CGH技术对儿童急性T淋巴细胞白血病进行研究发现，儿童急性T淋巴细胞白血病33％基因在9q34有扩增。并且这个区域有4Mb，内含NOTCH1基因，9q34的扩增导致许多基因过表达，其中包括MRLP41，SSNA1和PHPT1基因的过表达。尽管这些基因的扩增和表达不能完全明确与患者的不良预后有关，但该基因的复制标志着肿瘤细胞化疗后的存活。

    2.4   前列腺癌

    Michael[23]及Olsson等[24]研究发现PSA基因定位于13q区域转录在19号染色体上，整个长度为6kb。他们对整个长度的基因进行分析证明同系的KLK1、KLK2和HK基因家族表达高达70％~80％。而PSA基因又被称为KLK3基因。van Duin等[25]利用Array－CGH技术发现前列腺癌组织或细胞中8q上有5个区域8q21.13(81~82Mb)，8q22.1(94~96Mb)，8q22.2~3(101~103 Mb)，8q24.13(124~126Mb)，和 8q24.21(127~129Mb)高频率的扩增，而这些区域大部分远端都有含有MYC癌基因。MYC 和其它区域的另外 13 条与癌相关基因在前列腺癌组织中用Array-CGH法也被检测到。另有前列腺癌异种移植的PC339中，通过Array-CGH检测到8q上高扩增的两条基因。用定量RT-PCR检测肿瘤组织、正常组织、前列腺癌细胞和异体移植的前列腺癌组织中这16条基因的表达，发现这16条中有3条高表达，这3条基因为，PDP定位于 8q22.1(95 Mb)、PABPC1 定位于 8q22.3(102Mb)和 KIAA0196定位于 8q24.13 (126 Mb)。这些基因被认为是前列腺癌进展的标志物。

    2.5   其他肿瘤

    最近，日本学者Saito[26]用Array-CGH法对7个胆囊癌细胞系和5个胆管癌细胞系的染色体改变进行了检测，结果发现，在7个胆囊癌细胞系中，每一个都可以检测到6p21.32扩增，均可检测到的丢失区在3p22.3，3p14.2，3p14.3，4q13.1，22q11.21，22q11.23，而在5个胆管癌细胞系中，均可检测扩增的是7p21.1，7p21.2，17q23.2，20q13.2，丢失的在1p36.21，4q25，6q16.1，18q21.31，18q21.33，而扩增最大的区域却在13q14.3~q21.32 (大约11Mb)，丢失的最大区域在18q12.2~q21.1(大约15Mb)，显示出胆囊癌和胆管癌遗传学差异。有学者还利用Array－CGH技术研究了胰腺肿瘤[27]、宫颈癌[28]、胃癌[29]等多种肿瘤，描绘了相关染色体区域的DNA拷贝数及基因变化，丰富了分子生物学信息。

 3   在肿瘤研究及应用中存在的问题

    因Array-CGH可以进行自动化操作，具有高通量、简便、准确的特点，故可应用于临床诊断。Array-CGH的分辨率高，能够发现同一肿瘤不同亚型之间的差别，可用于鉴别诊断和分型，进而可以提示预后，选择适当的治疗方案。但存在的问题有：①价格较高。②仍需要一定量的特殊设备。③尽管与传统CGH相比，无需进行染色体识别，但仍需要一定技术的专业人员进行操作。所需试剂及芯片，目前国内尚无生产技术，也限制了该技术的临床应用。④需要的组织量仍较多，胃镜、肠镜活检标本及针吸活检标本不能满足检测的需要，限制了其临床应用。相信随着技术的发展和不断改进，成本的降低，Array-CGH技术可望得到广泛的应用，并对肿瘤的临床研究及临床应用提供指导作用。

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