p16与survivin蛋白在食管癌中的表达及意义

作者:宋长山,谭家驹,赵建亭

作者单位：广东省佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000       【摘要】  ［目的］ 探讨食管癌中p16与survivin蛋白的表达及其与临床病理特征的关系。［方法］采用EnVision免疫组化法检测62例食管癌及其相应癌旁正常黏膜组织的p16与survivin蛋白的表达。［结果］ 癌旁正常黏膜中的p16与survivin蛋白的阳性表达率分别为91.9%和6.45%，而相应癌组织分别为32.3%和72.6%。两组间均有显著性差异（P<0.01）。食管癌中p16表达的缺失与组织学分级、临床分期和淋巴转移有关（P<0.05）。而survivin蛋白阳性表达则与淋巴转移有关（P<0.05），而与组织学分级、临床分期无关（P>0.05）。p16与survivin蛋白在食管癌中的表达呈负相关(r=-0.495，P<0.01)。［结论］ p16表达的缺失与survivin蛋白的过度表达与食管癌的发生、进展和淋巴结转移密切相关，两者联合检测有助于食管癌病情的评估和预后判断。

   【关键词】  食管肿瘤

    食管癌的发生和发展与癌基因的激活、抑癌基因的失表达、细胞的凋亡失衡等有关。p16基因是第一个被证明为参与细胞周期调控机制的抑癌基因，其编码生成的16kD的p16蛋白是细胞增殖的负调节物[1]。Survivin基因是凋亡抑制基因的新成员，高表达于多种肿瘤组织和转化细胞，与肿瘤的发生发展及预后相关[2]。我们运用免疫组织化学方法检测p16与survivin蛋白在62例食管癌中的表达情况，分析其与相关临床病理参数的关系。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料

    本组62例，男性45例，女性17例，年龄46～70岁，中位年龄59.2岁。术前均未经过放疗和化疗，手术切除后病理证实为鳞状细胞癌。高、中、低分化者分别为18例、23例、21例。TNM分期为Ⅱ期25例、Ⅲ期25例、Ⅳ期12例。病理证实有淋巴结转移者43例，无淋巴结转移者19例。癌旁正常黏膜组织均超过癌肿边缘5cm。

    1.2   试剂与方法

    鼠抗人多克隆抗体p16和兔抗人survivin多克隆抗体购自福建迈新生物技术公司，EnVision试剂盒为DAKO公司产品(购自上海基因公司)。EnVision免疫组化法步骤如下：①石蜡切片脱蜡至水；②切片经修复热处理放入Citrate缓冲液(0.01mol/L，pH6.0)，微波煮沸10min；③经蒸馏水洗后，入3%过氧化氢5min；④蒸馏水冲洗后，再经TBS缓冲液冲洗，一抗温育30min；⑤经TBS缓冲液冲洗后，多聚物二抗EnVision温育30min；⑥TBS缓冲液冲洗后，DAB显色，镜下控制；⑦经蒸馏水冲洗后，苏木素复染、脱水、透明、封固。TBS代替一抗作阴性对照，选取已知阳性表达的组织作阳性对照。

    1.3   结果判断

    p16表达以胞核或胞核和胞浆出现粗细不等、深浅不一的棕黄色颗粒为阳性，而只见胞浆阳性表现为非特异性染色。Survivin表达的阳性信号为胞浆内或胞核内出现浅黄色微细颗粒～棕黄色颗粒。根据阳细胞百分比分5个等级：阳性细胞数<5%为0；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～5%为3分；>75%为4分。染色强度分为：0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕色；3分为棕褐色。总分计算方法为：阳性细胞数分值乘以染色强度所得分值的乘积。总分0～1分为阴性(-)；2～5分为轻度阳性(+)；6～8分为中度阳性(++)；9～12分为重度阳性(+++)。

    1.4   统计处理

    采用SPSS11.0统计软件对数据进行χ2检验和精确概率法。

    2   结   果

    2.1   p16与survivin蛋白在食管癌组织中的表达

    62例食管癌旁正常黏膜组织中p16和survivin的阳性表达率分别为91.9%和6.45%，而相应癌组织分别为32.3%和72.6%。两者在两组间表达差异有显著性（P<0.05）。见表1。

    高、中、低分化组p16阳性表达率分别为55.6%、26.1%、19.1%。p16的表达率随着恶性程度的增高而降低，高分化组p16表达明显高于中、低分化组(Ｐ<0.05)；而survivin在高、中、低分化组的阳性表达率分别为66.7%、73.9%和76.2%，各组间的表达差异无显著性（P>0.05）。

    Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期p16的阳性表达率分别为52%、20%、16.7%。Ⅱ期组p16表达明显高于Ⅲ、Ⅳ期(Ｐ<0.05)。而survivin在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组的阳性表达率分别为60.0%、80.8%和81.8%（P>0.05）。

    淋巴结是否转移患者中p16的阳性表达率分别为20.1%和57.9%，两组间有显著性差异（P<0.01）。Survivin在淋巴结是否转移患者中分别为81.4%和52.6%，两组间亦有显著性差异(Ｐ<0.05)。

    2.2   Survivin 与p16蛋白在食管癌中表达的相关性

    经统计学相关性分析，survivin和p16蛋白在食管癌组织中的表达呈显著负相关（r=0.495，P<0.01）。见表2。

    3   讨   论

    正常细胞内p16蛋白是CDKs的抑制蛋白，能特异性地在G1卡点中与cyclin D1竞争结合CDK4/6，抑制cyclinD1/CDK4/6复合物的蛋白激酶活性，阻止细胞通过G1/S期限制点进入S期，细胞停滞在G1期，从而使细胞的生长受到抑制。p16蛋白表达缺失可出现于多种恶性肿瘤组织中，因此p16基因又称多瘤抑制基因[3]。在肿瘤细胞内，p16基因出现突变、缺失或启动子区异常甲基化后可导致p16蛋白的非正常表达，出现cyclin D1与CDK4/6结合增加，细胞增殖失控,从而导致肿瘤发生[4]。多项研究表明食管癌组织中存在p16基因突变和甲基化，从而导致p16蛋白的表达缺失。Chen等[5]研究了69例食管癌发现33例存在ｐ16基因的突变，突变后的p16基因直接改变了表达蛋白的三维结构，从而导致活性的丧失。Fukuoka等[6]研究认为p16基因启动子区异常甲基化在食管癌中也存在较高的频率。

    本组结果显示食管癌组织中ｐ16阳性表达率明显低于癌旁正常食管黏膜组织（Ｐ<0.05），提示在食管癌组织中存在明显的ｐ16蛋白失表达。同时ｐ16阳性表达率随着食管癌的恶性程度和ＴＮＭ分期的增加而逐渐降低，在淋巴结是否转移两组间亦存在显著性差异(Ｐ<0.05)，有淋巴结转移者ｐ16基因蛋白表达率显著降低。这些均提示ｐ16蛋白的表达缺失在食管癌的发生、进展、转移复发过程中产生了重要的作用。因此ｐ16基因的异常可能是贯穿食管癌的发生发展过程中一个分子事件，ｐ16基因蛋白检测可作为临床辅助诊断食管癌、判定恶性程度、估计预后的辅助指标。

Survivin蛋白是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成员，基因定位于染色体17q25，有3个内含子和4个外显子构成，编码142个氨基酸组成的分子量16.5kD的蛋白质，是迄今为止最小的hIAP蛋白。Survivin通过特异性地与caspase-3和caspase-7结合抑制其转化为有活性的半胱天冬蛋白酶，从而发挥强大的抗凋亡作用[7]。也可与细胞周期调控因子CDK4形成复合体，使p21从CDK4复合体释放出来，p21进一步与线粒体caspase-3结合抑制其活性，间接对抗细胞的凋亡。在人类胚胎发育组织和绝大多数恶性肿瘤组织中均有survivin表达，且与肿瘤的恶性生物学行为有关，但不表达于终末分化的成人组织中[8]。Tanaka等[9]研究表明survivin基因可能是DNA去甲基化酶作用的靶点之一，其蛋白通过基因去甲基化表观遗传学模式来上调表达。Mega等[10]检测食管癌组织的survivin阳性表达率为56%（68/122），阳性表达患者明显预后不良，可认为是一个独立的预后指标。

    本实验结果显示，在食管癌组织中survivin的阳性表达率为72.6％，而癌旁的正常黏膜组织仅有6.45%，两者之间差异有显著性（P<0.01）。表明survivin基因在食管癌组织中的表达上调。提示其可能通过抑制食管癌细胞的凋亡，导致肿瘤细胞增殖失控和恶性化。同时本组有淋巴结转移survivin阳性率(81.4％)明显高于无淋巴结转移患者(52.6%)，两组间差异有显著性，说明survivin可以抑制食管癌细胞自身的凋亡过程，使得食管癌恶性程度的增强，导致食管癌容易发生转移。提示survivin基因的过度表达可能是食管癌发生中较早期出现的分子异常事件，可作为判断食管癌生物学行为的一个指标[11，12]。

    本组研究中显示p16和survivin基因在食管癌组织和相应癌旁正常黏膜组织的表达呈显著性负相关（P<0.01），两者可能协同参与了食管癌的发生发展。因此同时检测两者的表达有助于进一步了解食管癌的生物学行为，并为判断食管癌的淋巴转移、预后评估提供有价值的参考指标。

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[3] Arbiser JL. Molecular regulation of angiogenesis and tumorigenesis by signal transduction pathways: evidence of predictable and reproducible patterns of synergy in diverse neoplasms[J]. Semin Cancer Biol, 2004, 14(2):81-91.

[4] Ohtani N, Yamakoshi K, Takashi A, et al. The p16INK4a-RB pathway: molecular link between cellular senescence and tumor suppression[J]. J Med Invest, 2004, 51(3-4):146-153.

[5] Chen LH, Li YW, Gao LY, et al. An evaluation for the function and significance concerned to alterations of p16 3D structure with gene mutation in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2006, 23(2):208-212.

[6] Fukuoka T, Hibi K, Nakao A. Aberrant methylation is frequently observed in advanced esophageal squamous cell carcinoma[J]. Anticancer Res, 2006, 26(5):3333-3335.

[7] Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7[J]. Biochemistry, 2001, 40(4):1117-1123.

[8] Grabowski P,Scherubl H. Survivin--an anti-apoptosis protein[J]. Med Sci Monit, 2003, 9(11):25-29.

[9] Tanaka C, Uzawa K, Shibahara T, et al. Expression of an inhibitor of apoptosis, survivin, in oral carcinogenesis[J]. J Dent Res, 2003, 82(8):607-611.

[10] Mega S, Miyamoto M, Li L, et al. Immunohistochemical analysis of nuclear survivin expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Dis Esophagus, 2006, 19(5):355-359.

[11] Rosato A,Pivetta M,Parenti A, et al. Survivin in esophageal cancer: An accurate prognostic marker for squamous cell carcinoma but not adenocarcinoma[J]. Int J Cancer, 2006, 119(7):1717-1722.

[12] Vallbohmer D, Peters JH, Oh D, et al. Survivin, a potential biomarker in the development of Barrett’s adenocarcinoma[J]. Surgery, 2005, 138(4):701-706.