大肠癌患者外周血微转移与化疗及预后的关系

作者:徐善勇,梁金龙,孙 侃    作者单位：黑龙江省医院南岗分院，黑龙江 哈尔滨 150001        【摘要】  ［目的］ 研究大肠癌患者外周血微转移与化疗及预后的关系。［方法］ 选取大肠癌患者121例，应用RT-PCR技术，以CK20 mRNA为标志物，检测术前、术后第2天、首次化疗后血液微转移情况及与生存期的关系。［结果］ 术前血液CK20 mRNA微转移阳性率为53.7%，其中Dukes’A、B、C、D期的阳性率分别为20%、25%、78.5% 、75%, 4组之间有显著性差异(χ2=12.03，P<0.05)。术后第2天血液CK20 mRNA微转移阳性率为59.5%,手术前后阳性率无显著性差异(χ2=0.82，P>0.05)。化疗前后血液CK20 mRNA阳性率差异非常显著(χ2=25.59，P<0.05)。Cox模型分析提示CK20 mRNA阳性表达者及化疗无效者预后不佳(P<0.05)。［结论］ 化疗能降低大肠癌患者血液微转移的发生率；血液微转移提示患者预后不良。

   【关键词】  大肠肿瘤

    大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠癌患者中肿瘤的浸润和转移是肿瘤治疗后失败以及影响预后的主要原因。因此，在大肠癌患者中检测出肿瘤早期微转移的指标,对指导临床、改善大肠癌患者的预后具有重要意义。本研究通过RT-PCR方法检测大肠癌患者血液CK20 mRNA表达，研究其手术前后及化疗前后血液中微转移变化，并探讨大肠癌血液微转移与手术和术后化疗的影响及预后的关系。

    1   材料与方法

    1.1   研究对象

    随机选择2000年1月~2001年12月黑龙江省医院手术切除的大肠癌（组织学类型为腺癌）121例。其中男性69例，女性52例，年龄35~79岁，平均59.44±9.40岁。所有病人术前均未接受化疗、放疗及其它辅助治疗。其中高分化腺癌38例，中分化腺癌62例，低或未分化腺癌21例。Dukes’分期：A期25例、B期28例、C期56例、D期12例。标本采集时机为：术前、术后第2天、术后第1个疗程化疗结束后当天(术后化疗均在术后第15天开始进行，方案为FOLFOX4方案：氟尿嘧啶、奥沙利铂、亚叶酸钙)。取血部位为对侧上肢浅静脉，弃去注射器抽取的前5ml血，以减少标本被皮肤细胞污染可能。

    1.2   CK20 mRNA的检测

    1.2.1   引物设计

    CK20 mRNA引物参考相关文献，由生工公司合成，上下游引物序列分别为：5′-CCTCTGACGTCCATCATCTC-3′，5′-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3′，预期产物DNA为462bp。同时以β-actin为内参照，其引物来自鼎国公司RT-PCR试剂盒，其预期产物DNA为540bp。

    1.2.2   RNA提取

    在标本获得后6h内进行，对血液标本以密度梯度离心法进行单个核细胞分离，以Tripure提取得到的单个核细胞RNA，分光光度计检测获得RNA样本D值，确定样本A260/A280>1.65，排除RNA酶污染可能。行RN电泳，见清晰的18S、28S两条带，证实RNA无降解，可为RT-PCR反应模板。

    1.2.3   RT-PCR反应

    使用Promega Access RT-PCRSystem试剂盒，反应体系25μl，参照试剂盒说明行一步法CK20 mRNA RT-PCR扩增，同时每组体系均设立β-actin为内参照。反应条件如下：48℃ 45min，94℃ 2min，进入PCR循环，94℃30s 60℃1min、68℃2min，共40个循环，68℃7min终延长，4℃保存。

    1.2.4   产物鉴定

    取反应产物5μl，行电泳。电泳条件：1×TBE缓冲液，2%琼脂糖凝胶，电压5V/cm，时间30min～40min。凝胶成像系统观察，如在540bp处出现清晰条带者可证实RNA无降解和反应体系适当。如反应产物在462bp处出现清晰条带者为待测标本CK20 mRNA阳性，无此条带者为阴性。

    2   结   果

    大肠癌患者血液CK20 mRNA阳性率为53.70%(65/121)。其中Dukes’A、B、C、D期的阳性率分别为20.0%(5/25)、25.0%(7/28)、78.52%(44/56)、75.0%(9/12)。Dukes’A、B、C、D期之间CK20 mRNA差异有显著性(χ2=12.03，P<0.05)。大肠癌术后第2天血液CK20 mRNA阳性率为59.5%(72/121)，其中Dukes’A、B、C、D期的阳性率分别为24.0%(6/25)、28.57%(8/28)、85.71%(48/56)、83.33%(10/12)，均较术前为高，但统计学分析，手术前后血液CK20 mRNA阳性率差异无显著性(χ2=0.82，P>0.05)。大肠癌术后首次化疗结束当天血液CK20 mRNA阳性率为26.7%(33/121)，其中Dukes’A、B、C、D期的阳性率分别为4.0%(1/25)、10.79%(3/28)、41.11%(23/56)、50.0%(6/12)，统计学分析显示：术后化疗前后血液CK20 mRNA阳性率差异有显著性(χ2=25.39，P<0.05)；与术前相比，术后化疗结束后血液CK20 mRNA阳性率亦显著降低(χ2=17.56，P<0.05)。

    大肠癌患者中微转移阳性与阴性中位生存期分别为25、47个月(χ2=6.54，P<0.05)，微转移阳性患者化疗后微转移仍阳性与转阴者中位生存期分别为8、27个月(χ2=7.32，P<0.05)。

    Cox模型分析显示，大肠癌患者的预后与患者的年龄、性别、分化程度无关，但与化疗疗效、CK20表达有密切关系。化疗后微转移未转阴者化疗死亡风险增加(P<0.05)，相对危险度为2.846(95%CI：1.101～8.284)；CK20阳性表达者预后较阴性者差(P<0.05)，相对危险度为3.773(95%CI：1.195～11.382)。

    3   讨   论

    众所周知，大肠癌原发灶切除后出现复发或转移的机会仍很高，而血行转移是术后影响患者预后的主要因素[1]。若能早期发现转移灶，及时治疗可能有利于控制疾病的发展，但传统的影像学检查方法对于微转移灶则不能提供可靠的证据。微转移是指常规检查方法不能发现的单个肿瘤细胞或直径＜2mm的微小转移。RT-PCR检测微转移是目前敏感性较高的方法，可检测出106～107个细胞中一个肿瘤细胞[2]。CK20 mRNA表达范围较特异[3]，仅局限在胃肠上皮细胞，在正常骨髓、血液和淋巴结中均无表达，几乎全部胃肠道肿瘤[4]以及在侵袭、转移、扩散到其它组织器官时均保持稳定表达[5]。本文结果显示在临床分期为Dukes’A、B、C、D期大肠癌病例中，术前血液中检出微转移阳性率分别为20%(5/25)、25%(7/28)、78.5%(44/56)、75%(9/12)(χ2=12.03，P<0.05)，显示血液微转移与肿瘤分期密切相关，肿瘤分期越晚微转移越容易发生，与临床上中晚期大肠癌易发生远处转移和转移部位较多相吻合。已有多项研究证实手术刺激增加恶性肿瘤细胞转移，赵增顺等[6]发现胃癌根治术中早期结扎肿瘤引流血管者与不结扎引流血管者相比较，后者术中门静脉血中检出肿瘤细胞可能性更大。陈静等在对恶性肿瘤术中用品进行脱落细胞检测后发现恶性肿瘤术中使用的手套、纱布等都不同程度肿瘤细胞附着。在本组研究中，大肠癌患者血液CK20 mRNA阳性率为53.70%(65/121)，术后第2天血液 CK20 mRNA阳性率为59.5%(72/121)，但两者之间无统计学差异(χ2=0.82，P>0.05)，表明在对恶性肿瘤行手术治疗过程中，由于机械刺激和沾染等原因可能增加肿瘤转移或术野肿瘤细胞残留，与文献报道相符。

 术后化疗结束后血液CK20 mRNA阳性率为26.7%(33/121)，统计学分析显示：术后化疗前后血液CK20 mRNA阳性率差异非常显著性(χ2=25.39，P<0.05)；术后化疗结束后与术前相比血液CK20 mRNA阳性率亦显著性降低(χ2=17.56，P<0.05)。显示术后化疗对微转移细胞存在杀灭作用。本组用FOLFOX4方案术后化疗，结果表明术后第1个疗程化疗结束后微转移检出率显著降低，证实该化疗方案对大肠癌术后微转移的治疗有明显疗效。大肠癌患者中无淋巴结转移A、B期患者被认为是很少复发的，对这些患者并不推荐化疗[7]，但实际上，微转移的肿瘤细胞已存在，仍有30%~40%发生了复发或转移。因此，监测微转移可识别出高危患者[8]，并指导其治疗。

    我们对大肠癌患者进行Cox多因素分析发现，血液中检测到微转移的患者，其死亡危险性明显增加。Maruyama等[9]亦发现淋巴结中无微转移的Ⅰ期肺癌患者5年生存率为90.9%，而检测出微转移者仅为64.4%。由此可见，微转移是一个独立的预后指标。微转移的检出是肿瘤复发的高风险因素。监测肿瘤微转移可对选择术后化疗方案及预后评估起到重要作用。

【参考文献】[1] Yuasa N, Nimura Y. Survival after surgical treatment of early gastric cancer, surgical techniques, and long-term survival[J]. Langenbecks Arch Surg, 2005, 390(4):286-293.

[2] Zhou QH, Gong YL, Qin Y, et al. Value of diagnosing micrometastasis by nested RT-PCR in the peripheral blood and bone marrow in non-mall cell lung cancer patients[J]. Chin J Oncol, 2003, 25(1)∶62-65.

[3] Wyld DK, Selby P, Perren TJ, et al. Detection of colorectal cancer cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin 20[J]. Int J Cancer, 1998, 79(3):288-293.

[4] Huang P, Wang J, Guo Y. Molecular detection of disseminated tumor cells in the peripheral blood in patients with gastrointestinal cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2003, 129（3）:192-198.

[5] Lowe B, Avila HA, Bloom FR, et al. Quantitation of gene expression in neural precursors by reverse-transcription polymerase chain reaction using self-quenched, fluorogenic primers[J]. Anal Biochem, 2003, 315(1):95-105.

[6] 赵增顺, 王少文, 焦喜林, 等. 胃癌根治术对单细胞入血转移的影响[J]. 华人消化杂志, 1998, 6(7):610-611.

[7] Weitz J, Kienle P, et al. Detection of disseminated colorectal cancer cells in lymph nodes, blood and bone marrow[J]. Clin Cancer Res, 1999, 5(7):1830-1836.

[8] Miyake Y, Yamamoto H, et al. Extensive micrometastases to lymph nodes as a marker for rapid recurrence of colorectal cancer: a study of lymphatic mapping[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(5):1350-1357.

[9] Maruyama R, Sugio K, Mitsudomi T, et al. Relationship between early recurrence and micrometastases in the lymphnodes of patients with stageⅠnon small cell lung cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1997, 114(4)∶535-543.