细菌纤维素/柚皮苷复合支架修复骨缺损的实验研究

造成骨缺损的因素很多,如何找到一种有效的方式修复骨缺损,消除死腔,恢复骨的连续性,己经成为急切解决的问题,目前人们比较关注于种子细胞、支架、细胞因子的研究。细菌纤维素,BC)是一种新兴的生物材料,其主要特点为具有良好的生物相容性,可降解性,适宜的微孔径及高的孔隙率,具有的纳米纤维与骨中的胶原纤维在结构和形态上是一致的[I],并且其结构与体内ECM存在相似性,容易塑形,呈三维网状结构等优点,因此在组织工程支架,人工血管、皮肤等方面拥有很好的应用前景,是诸多学者关注的焦点之柚皮甙CNTari吧ill,是一种黄酮类化合物,主要来源于骨碎补及芸香科植物柚的果实,研究发现,柚皮甙具有诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用⒓9",增加骨细胞活性",促进骨愈合。本实验通过柚皮甙/BC材料的研究,探讨其材料的骨传导性及诱导成骨能力,证实该材料具有明显的加速成骨作用,为临床应用提供了理论依据。材料和方法1材料的制备及分组11BC水凝胶制备将研磨好的l%蛋白胨缓慢加入沸腾蒸馏水中,保温10lllln,直至其溶解,再加入4%-9%的葡萄糖,调解冰醋酸体系pH值为45,装入三角培养瓶中,制成培养基。无菌条件下,将几环木醋杆菌菌种转接于培养基中,加入少量酵母粉,然后再将此种溶液6%放入另一培养基,在⒛℃培养7d即可得BC水凝胶。将BC水凝胶放在高温蒸馏水⒛℃中保温2h,然后取出,清洗2次,再将BC放于沸腾的NaoH溶液ω~5m。l/D中15min,再将其放入1%J%的NaOH溶液中2d,最后用蒸馏水多次冲洗BC水凝胶后,将其放入蒸馏水中冷藏待用。12柚皮苷/BC的制备过程:将BC凝胶置于总质量为10%柚皮苷提取物的溶液中,岁℃静置1d,用蒸馏水洗诤,冷藏待用。13支架材料的消毒:将冷藏待用的支架材料放入环乙烷高温消毒机中⒛h,制成12cm×0~6cm的片状,待用。2动物模型的建立及分组21动物模型的建立将大白兔称重后经耳缘静脉注射乌拉坦麻醉(20%乌拉坦5mL/kg),按外科手术常规备皮,消毒,铺巾,做颏下区正中约5.0cm切口,逐层分离,止血,注意保护兔颌下区动静脉,暴露下颌骨体部骨板,用转速为15×104r/min的低速马达,直径分别为3mm、4mm的裂钻在双侧下颌骨下缘下颌角前方15cm,下颌骨体颊侧中下2/3处,分别在双侧「颌骨体处,在生理盐水冷却下,制备成12mm×10mm×6mm的骨缺损,生理盐水反复冲洗,保留双侧骨膜。将制各好的材料放置在缺损处,逐层缝合,关闭伤口。于1、2、3月分次取其缺损处标本,测量观察指标。分组:⒉只大自兔,分成2组,每组12只,分别为对照组和实验组.2.2术后观察指标2.21一股观察:术后观察动物的活动,进食,精神状况,创口的愈合情况.2.2.2影像学观察:CBCT观察骨缺损区外形及材料的改变情况，材料与周围组织接触状况。CBCT扫描骨缺损区内8个不同位点，记录CT值，取均值，并做统计学分析。2.2.3组织形态学观察:分别于4.8.12周处死动物，取下领骨缺损区标本，取材包括骨缺损区周围不少0.5cm的正常组织，将标本材料浸泡上4%多聚甲醛溶液固定，后用20%甲酸脱钙，乙醇脱水，包理，切片，I-IP染色，光学显微境下观察。2.2.4扫描电镜观察:分别取4,8,12周动物下领骨缺损区标本，将取i的标本浸于4%的戊二醛溶液进行标木固;}40h后，将其用蒸馏水冲洗3--5遍X15min/次)，然后进行乙醇梯度脱水，在醋酸异戊酷中置换15min,最后在液氮冷冻干燥日由真空，喷金，JAM-6360LV扫描电镜下观察3统计学分析所有的数据各组取均值进行比较，应用SPSS17.0软件，以方差分析法作显著性分析结果1一般状况观察:1只动物由于麻醉过量导致死亡，其他实验动物正常存活，术后30min苏醒后，体能明显卜降第24开始进食，进食量较少，无感染。术后第3天进食趋于正常，精神状况良好，2周后创口愈合，植入材料无排斥现象2CBC丁检测观察术后4周，对照组:材料一与周围骨组织接触紧密，边界尚清，密度明sis低于l常胃，实验组:材料与周围组织紧密接触，材料植入骨缺损区椭圆形较模糊，缺损区骨密度略低少周围骨质，密度不均匀。术后8周，对照组:骨缺损区透射影像面积明显减少，边界模糊，材料部分吸收。实验组:材料有明显吸收，材料与骨质边界模糊不清，边界密度明显增高(图1,2>。术后iz周，对照组:材料大部分被吸收，边界模糊，骨痴嵌入生长明显，密度增高。实验组:材料基本吸收，边界模糊不清，材料与骨进行骨性连接。3组织学观察术后4周标本，对照组，·黝缺损周边破骨细胞(coB)较多，有较多的纤维组织生成:实验组肾缺损区有大量的纤维骨痴形成，大量的oB，纤维组织在材料表面形成小的突起。术后8周，对照组:新生胃·长入，不成熟骨小梁排列不规则，大量的OB实验组:材料内有大量的骨小梁形成，排列不规则，材料吸收明显(图3,4)。术后12周，刘一照组:纤维骨痴形成骨组织，骨小梁排列较规则。实验组:大量成熟骨小梁排列整齐，材料基本被降解。4扫描电镜观察术后4周标本，对照组:材料与骨之间有明显的空隙;实验组:材料与骨之间界限模糊不清，两者结合相对紧密。术后8周，对照组:材料与骨质的结合较紧密，界限不明显，有骨痴形成。实验组:有大量的新生骨痴形成，材料与骨质结合紧密(图5,6)。术后12周，对照组:有胶原纤维组织长入材料的内部，材料与骨质结合紧密，材料大部分吸收利用实验组:材料与骨组织之间形成骨性连接，材料与骨组织之间的颜色较一致。5统计结果经过各时间段对照组/实验组渭·缺损CBCT骨密度值可知，各组术后4,8.12周缺损区骨密度值均随时问的延长而增加。通过方差分析，P<0.05有统计学意义(表1).讨论细菌纤维素(CBC)不仅纯度高、而且结晶度也高的纳米结构纤维素，具有一定的可调控性，可塑形性，和大量的轻基官能团，从而使得BC支架材料的制备具有一定的可设计性。并目.BC具有更高的机械强度、更多的微孔和优异的生物可降解性、良好的可铸性，其与·胃结合能力很强}}}oHutchens等]}]指出细菌纤维素的高亲水性使微粒能够渗入它的内部网络结构。从而形成了低钙轻基磷灰石，是骨的主要组成成分。并且可以做为一种合适的基质用于诱导轻基磷灰石的形成。伴随着分子生物学的迅猛发展，细胞因子的研究进入了一个崭新的领域。中药通过提高成骨相关基因TGF-日，BMPS表达，来加快骨折的愈合。李楠fiol证实补骨合剂对一口腔BMPS蛋白含量有很大的影响，得出中药对BMPS的早期释放，浓度的提高起到了关键性的作用，从而加速骨折愈合。实验证实人参皂普(Rgl)加快BMSCs的DNA合成，使得细胞进入增殖周期，通过细胞内信息的传导促进骨髓基质细胞分化增殖.刘钮瑜[[13]等人证实去卵巢大鼠模型而导致的骨质疏松，何首乌能有效地进行防治，何首乌的有效成分促进骨细胞ALP表达、胶原的合成，同时发现大黄素对BMSCs早期向OB的增殖分化有很大的作用。众所周知骨碎补为骨伤科常用中药，具有补肾强骨，止痛等功效L13]。骨碎补水提液能促进小鼠成骨细胞株MC3T3-El的增殖、分化和钙化的作用，抑制牙槽骨吸收〔’5」。但是骨折愈合以复方中药为多，复方中药根据配伍、归经、药味、药性关系组合而成，相互协同发挥作用，但复方中药的成分较多，也较复杂，可能相互之问发生化学反应，从而某些成分产生拮抗作用。所以对单味中药的研究尤为重要，研究单味中药的成骨机制，为今后的复方中药的研究指明方向。袖皮贰是一种黄酮类化合物，为屑·碎补主要成分之一，柏皮试能够促进成骨细胞的增殖，并民诱导13}1-SCs向成骨细胞分化,促进有机磷向无机磷的转变，从而加速了钙盐沉积。本实验通过袖皮贰与BC复合实验的研究，证实复合材料有良好的骨诱导性，对各时间点缺损区的观察发现:实验组材料一与周围组织结合较对照组紧密，同时实验组材料降解速)全决于对照组，实验组在8周时材料一与周围组织边界模糊不清，12周时材料与周围组织融合达到了影队连接，与此I}}}时对照组滞后于实验组扫描电镜显不:实验组和对照组材料一与周围组织间主要山纤维结缔组织沟成，实验组较对照组致密，空隙更小，更加紧密。在4,8,12周实验组中有大量密集的成骨细胞，同时钙盐的沉积明显好于对照组，实验组具有良好的骨·活性，对照组的成骨速度明显落后于实验组，说明实验组具有较强的刺激成哥作用，促进骨缺锁愈合，12周时实验组骨小梁排列整齐，密度增大，新生骨旱现皮质骨样结构，此时对照组骨小梁排列不整齐，皮质h.厚薄不均，形态不规则。随着时间推移材料都有不同程度降解，实验组新生骨面积比例均大于对照组，各组术后4,8,12周新生骨面积百分比均随时间延长而增加，P<0.05，有统计学意义，通过实验研究:复合材料不仅能提供骨支架，骨传导的作用，而且具有良好的骨诱导性和较强的刺激成骨能力，促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉积成骨，对修复骨缺损有很好的效果。相信抽皮试/细菌纤维素材料具有广阔的发展前景，有待于进一步的开拓，为今后的实验研究提供依据。参考文献祝晓玲,祝彼得黄芪体外作用对贫血小鼠骨髓基质细胞分泌SCF的影响[J]细胞与分子免疫学杂志,⒛02,18(4):396-398刘钰瑜,姚卫民,艾春媚大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响[J]中国临床药理学与治疗学,2005,10(2):191-195