羟基磷灰石-凝胶支架复合成骨细胞修复兔颅骨缺损的组织学评价
发表时间：2014-10-13 浏览次数：1174次
组织工程技术利用种子细胞与可降解支架材料复合的万法在体内形成具有一生理功能的骨组织，有望成为一种骨缺损修复的全新治疗模式。本实验将成骨细胞与新型仿生材料一经基磷灰石/凝胶复合物联合培养，以此构建的复合体修复兔颅骨缺损，通过组织学指标评价其对骨缺损的修复能力，为进一步临床应用提供实验依据。材料和方法1HAP/GEl支架成骨细胞复合体的构建按照参考文献的方法，将培养的第3代成骨细胞制成细胞悬液，浓度为5X106mL，将H.AP/GEL支架浸泡于其中，负压抽吸使成骨细胞悬液充分进入支架的多孔问隙中，少卜在370C,5%C0,培养箱中培养7d后用于骨缺损修复实验。2动物模型建立动物称重后用3%戊巴比妥钠，30mg/kg腹腔注射麻醉将兔附卧位固定在手术台土，头部备皮，头顶部中线部位做民约5cm纵行切口，完整剥离骨膜暴露颅骨，在颅骨矢状缝两侧0.cm处环切刀慢速全层切除直径为1cm的圆形骨缺损，手术过程辅以滴水降温(图1)。骨缺损处分别植入:HAP/GEL-Cell复合物HAP/GEL、留置空白缺损、自体颅骨。放入材料后，覆盖比宽为15mmX25mm海奥胶原膜，保留硬脑膜面与海奥胶原膜双层膜之间的血凝块。然后术区骨膜对位缝合，分层缝合皮卜组织和皮肤。术后肌注庆大霉素4万单位，1次/dX3d，预防感染。3大体观察动物处死取材后观察植骨区新生组织的生长情况及骨愈合程度。4脱钙切片制备及染色分别于术后4,8.12周采集颅骨骨缺损两端正常组织在内及植入材料骨块，10%中性福尔马林固定，50%甲酸室温下脱钙处理，每隔3天更换一次脱钙液，脱钙标准的判定采用草酸溶液滴定和针刺结合的方法，即2%的草酸滴定脱钙液无沉淀及针束」易穿入即可。脱钙时间大约持续2周。标本流水冲洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。5硬组织切片制备及染色分别于术后4.8.72周动物处死后，采集颅骨骨缺损两端正常组织在内及植入材料骨块，4%甲醛固定1周，然后脱水、浸润、包理，在Leicasp1600型硬组织切片机上沿冠状面缺损区的中心部位切取制作2张厚约50Nm}80p.m的切片，HE染色后普通光学显微镜观察。结果1大体观察8周时一取材带修复材料胃·块，轻基磷灰石/凝胶/成骨细胞复合物表面可见有较多骨痴形成并向中央集中，与周围正常旨组织界限模糊;轻基磷灰石/凝胶修复整个缺损区域颜色偏黄、硬度偏低，边缘比较清晰，其周边与骨断端之间已有较牢固的胃性连接形成，打」之有一定的强度(图1}。2组织字观蔡FLAP-CF;T支架成骨细胞复合物杭入后8周，观察到粗大的纤维组织插入到材料间隔中，内部有较多的成纤维细胞;12周发现，复合材料部分降解，材料之间腔隙变大，可见多个材料间Isr}i内己民满新生的骨小梁(图2,3)。3硬组织观察从硬组织切片中，我们可以看到s周时，HAP-(}EL负载成胃·细胞材料已经出现降解，材料密度降低，周围骨组织开始向材料间隙仲入;12周时，材料降解分离，被骨组织分隔，较多新生骨小梁存在于支架空隙内，但未连接成片(图4,5)。讨论本研究首次采用了低温合成、共沉淀等一系列仿生技术，并优化羚基磷灰石/凝胶复合物在支架构成中的比例，使轻基磷灰石和凝胶以化学键结合，合成了轻基磷灰石/凝胶纳米复合物。仿生技术使l复合物除具备与天然骨相同的机械性能以承重外，还具备良好的生物相容性和理想的降解速率马。其在微观结构上成功模拟了天然骨的纳米结构，与目前常用的商品化骨修复材料比较，HAP-GEL复合物具备更好的机械性能，能够更好地模拟细胞外骨基质。本研究旨在探索轻基磷灰石/凝胶复合物作为新型组织I.程骨在兔颅骨缺损中的修复效果。体外构建的组织工程化骨植入体内后同样必须迅速建立充分的血供为种子细胞功能活动提供充足的营养，只有这样才能保证组织工程化骨的成活，人工骨才能演变成自体骨，从而在体内发挥持久的生理功能，因此，支架材料的微孔直径是个关键问题「5,6]。本实验中新型仿生轻基磷灰石/凝胶材料的孔隙大小及平均孔隙率符合骨组织工程理想支架材料的要求，有利于周围血管的渗入，为血运重建提供了广泛的空间。同时，材料的体内降解是组织工程学对材料的基本要求，这种降解必须与体内新生的组织相匹配，本实验中材料的纳米级I1基磷灰石具有小尺寸效应和表面效应使其易于通过体液介导的溶解或细胞介导的吸收过程达到降解的目的「7-9}。本实验的组织学观察到HAP-GEL支架复合成骨细胞复合物材料植入骨缺损8周后，纤维组织插入到材料间隔中，内部有较多的成纤维细胞，在12周时，材料一部分降解，可见多个材料间隔内己长满新生的骨小梁，说明此复合材料在颅骨缺损修复中起到了细胞依托支架以及骨传导的作用。骨组织的重塑是一个长期过程，包括缺损周围出血与血凝块形成，血块机化后肉芽组织形成，结缔组织和上皮组织代替肉芽组织，原始的纤维样骨形成，成熟的骨组织代替不成熟骨质Uo,uJ。骨组织工程就是构建一个移植体，可附载有成骨活性的活细胞、诱导性生长和分化因子等，支持细胞粘附、迁移和增殖，来模拟骨修复的自然发生过程，加速骨再生，移植后要在骨缺损的精确解剖部位引发骨愈合反应，恢复骨组织形态和功能的完整性[}z-ial。本研究中轻基磷灰石一凝胶复合成骨细胞复合物材料加速了骨修复的自然过程。[参考文献]王程越,姚玉胜,王树峰,等组织工程骨修复兔下颌骨缺损的实验研究[J].口腔医学研究,2012,28（3）:213-217杨志明,黄富国,秦廷武,等生物衍生组织工程骨植骨的初步临床应用[J].中国修复重建外科杂志,2O02,16(5):311-314
