半连续切片角蛋白IHC检测口腔鳞癌颈淋巴结隐匿性转移的研究
发表时间：2014-08-01 浏览次数：1024次
口腔鳞癌占口腔领面部恶性肿瘤的80%以上，且易发生颈淋巴结转移。口腔鳞癌颈淋巴结隐匿性转移被认为是影响患者预后的首要因素，如果能在术前、术后准确检测颈淋巴结隐匿性转移，进而指导个性化临床治疗方案的制定，将有利于进一步提高口腔鳞癌的疗效。 1材料与方法 1.1临床资料和标本选取广东医学院附属医院口腔科2007年9月一2010年4月间住院行原发灶扩大切除术及I型改良根治性颈淋巴结清扫术(沿胸锁乳突肌前缘解剖寻找附神经，选择性地保留副神经)治疗的口腔鳞癌患者45例，其中男25例，女20例;舌癌19例，颊癌8例，牙跟癌13例，口底癌5例;按肿瘤生长方式分:外生型13例，溃疡型17例，浸润型15例;病理学分级:高分化30例，中分化、11例，低分化4例;根据国际抗癌联盟CUICC>2006年分期标准分:T1期18例，T2期16例，T3期8例，4期3例。颈淋巴结清扫术后共收集颈淋巴结226。枚(初次分离后再送病理科请经验丰富的病理医生再次分离)，淋巴结标本标记，10%福尔马林固定，每枚淋巴结均分为两半，一半行半连续切片IHC染色检测，一半行常规HE染色检测。 1.2纳人标准临床触诊检查未见颈淋巴结转移者;术前未接受抗肿瘤治疗措施;术前、术后原发灶均经病理证实为口腔鳞癌;病例均行颈淋巴结清扫术，术区包括I-V区;临床和病理资料完整者。 1.3主要试剂鼠抗人CK(广谱)单克隆抗体(AEl/A-E3),PV-9000二步法免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒等，以上材料均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.4切片染色方法1.4.1常规HE染色 1.4.2免疫组化染色(PV9000二步法)1)石蜡切片脱蜡和水化;2)高压修复抗原;3)灭活内源性过氧化物酶;4)滴加一抗CK(AE1/AE3);5_滴加试剂1(PolymcrHelper)、试剂2<polvperoxidase一anti-mouserabbitIgG);6)DAB显色:室温显色，镜下控制反应时间(3^M0min);7)苏木素复染;8)梯度酒精脱水、封片。 1.5结果判定HE染色结果:细胞浆红色，细胞核蓝紫色。HC'染色阳性表达:光镜下，胞浆呈棕黄色或棕褐色为阳性表达，胞浆着色越深显示该蛋白的表达越强，细胞核呈苏木素紫蓝色;组织细胞胞浆、胞核均呈紫蓝色为阴性表达。 1.6统计方法采用SPSS10.0统计分析软件进行X检验统计分析。 2结果 半连续切片角蛋白CK<AEl/AE3)免疫组化染色和HE染色法检测朽例口腔鳞癌颈淋巴结隐匿性转移阳性率分别是31.110oC14/45例)和11.110oC5八5例)，半连续切片IHC检测颈淋巴结的隐匿性转移阳性率明显高于HE染色，HE染色检出的阳性淋巴结全部被IHC所检出，差异有统计学意义(P<O.05)，见表1。 3讨论 本研究通过半连续切片结合免疫组化染色检测生5例口腔鳞癌患者术后颈淋巴结中角蛋白的表达，发现l}例患者颈淋巴结存在隐匿性转移，而常规HE染色仅检测出3例。10等3认为大部分淋巴结隐匿性转移灶是以很小的肿瘤细胞团或单个肿瘤细胞的形式存在.与本研究相符;常规HE染色正常细胞和肿瘤细胞具有相同的颜色，依靠组织结构和细胞形态判断是否转移，对较大转移淋巴结有效，但难以发现微小转移灶。国外文献报道口腔鳞癌颈淋巴结转隐匿性移率在20%一30%之间u}。本研究口腔鳞癌颈淋巴结隐匿性转移率为31.110，与国内外研究者基本相符。国内外许多研究认为C'.K(}lEl!AE3)是较稳定的单克隆抗体，采用角蛋白免疫组化法检测上皮及上皮来源恶性肿瘤淋巴结隐匿性转移是准确可靠的方法。国外学者以CK作为肿瘤指示物的免疫组化染色在检测乳癌、直肠癌、胃癌的淋巴结转移精确度上明显高于传统的HE染色的形态学检测，能更准确评价淋巴结隐匿性转移情况匡oKwon等0-利用免疫组化检测69例pN。头颈鳞癌的1710枚淋巴结，其中13例中有14枚淋巴结显示角蛋白阳性。Rhee等}r对10例常规HE检测无转移的头颈鳞癌颈淋巴结行免疫组化复检，对阳性部位重新评阅HE染色切片，发现均有高度异型细胞，包括核大深染、核一质比例增高等恶性肿瘤细胞的组织学改变，可见若没有免疫组化切片的对比，这些恶性肿瘤细胞易被遗漏。常规HE染色切片容易漏检淋巴结隐匿性转移灶，因为每枚淋巴结仅取1}-2张切片:1张5}m的切片，相对直径0.5cm的淋巴结，取材量仅占1/10000淋巴结内较小转移灶易被遗漏，直径0.5mm的转移灶被检出可能性只有110a，直径0.2mm的转移灶检出的可能性仅为400Cs7。某些临床检测为阴性淋巴结的口腔鳞癌(clinicalnegativelymphnode,cNo)，其淋巴结隐匿性转移灶多小于5rnm，完全连续切片可提高隐匿性转移灶的检出率，但费时费力。本研究采用间隔0.5mm的半连续切片既保证实验可行性，大幅度缩短检测时间，又能保证实验结果的可信度。 目前IHC染色技术已成熟，操作简单，费用低，易于推广。本研究认为对口腔鳞癌常规HE检查无转移的颈淋巴结行半连续切片角蛋白IHC染色检测，能更准确的判断颈淋巴结隐匿性转移情况，为准确判断疾病预后及制定合理个性化治疗方案提供重要依据。 参考文献 Rhee D, Wenig B M, Smith RV. The significance of immuno-histochemically demonstrated nodal micrometastases in pa-bents with squamous cell carcinoma of the head and neck [J].Laryngoscope, 2002，112(11)，1970一1974. Becker MT, Shores CG, Yu KK,et al. Molecular assay to de-tect metastatic head and neck squamous cell carcinoma [J].Arch tolaryngol Head Neck Surg, 2004，130(1)，21一27
