维吾尔族、汉族婴幼儿口腔白色念珠菌的分布与龋病相关性研究

　　龋病是儿童最常见的一种口腔疾病。婴幼儿龋(Earlychildhoodcaries,ECC)表现出了严重的社会公众健康问题已经受到全世界各个国家的高度重视。变形链球菌是主要致龋菌，乳酸杆菌是龋齿的标志菌，已被全世界公认。近年来，随着对龋齿微阵列的研究，除放线菌和韦荣球菌匡等对定植于牙面的菌斑之间相互作用的研究日益深人外，对白色念珠菌与ECC的相关性的研究也日益受到国内外研究者的重视。　　白色念珠菌(candidaAlbicans)又称白假丝酵母菌，较乳酸杆菌的产酸潜能更强，可以分解利用山梨糖、木糖醇等变形链球菌不能利用的糖类产酸，产酸溶解轻基磷灰石的能力为变形链球菌的2倍。此外，白色念珠菌易粘附于牙釉质、牙本质和牙骨质表面困，研究者推测白色念珠菌可能有很强的致龋潜能川。白色念珠菌与龋病的研究已成为研究热点，但其在性别之间分布差异的研究还比较少，民族之间分布差异的研究还是空白。本研究旨对乌鲁木齐市幼儿园的维吾尔族和汉族儿童口腔白色念珠菌的检出情况进行分析，探讨白色念珠菌与FCC相关危险因素。　　1材料与方法　　1.1研究对象通过伦理委员会的批准及征得幼儿园的准许和签订家长知情协议书，采用分层整群抽样方法随机调查乌鲁木齐市区4所双语幼儿园3^'J岁儿童389名。维吾尔族144名，汉族245名，两民族比例约为3/5。纳人标准:所有儿童在检查前1个月内未服用抗生素，无系统性疾病，无先天性疾病及表现出任何症状的口腔豁膜病，口腔内未佩戴矫治器。受试儿童于采样前2h禁食，并用PBS液漱口。采集样本前与其家长签署知情同意书。　　1.2主要试剂科玛嘉念珠菌显色培养基<CHRCMagarCandida,CAC，法国科玛嘉公司)，BiospinFungusGenomicDNAExtractionKit<Bioflux),;Taq聚合酶等PCR试剂(北京博迈德生物工程公司)核酸染料，MarkDL2000(北京生工生物)。　　1.3样本采集对无龋儿童用无菌木签取上下领第一乳磨牙颊侧颈1/3及上前牙唇面颈1'3菌斑，对婴幼儿龋儿童用无菌挖器取前后龋损牙的深部牙本质及龋损牙釉质，放人消毒灭菌的装有500}}LPBS液的2m工、无菌离心管中。　　1.4白色念珠菌的培养菌斑法获得的样本，用VERTEX震荡2min，将所有样本调整到300，弃去多余液体，于6000g离心10min.弃去上清液，用100}.L.无菌PBS液重新混悬，取出20L接种于CAC培养基。唾液法获得的样本，直接取20uL接种于CAC培养基。接种后的培养基在370C培养，24-48h观察菌落颜色对CAC培养样本进行判断。　　1.5白色念珠菌的鉴定　　1.5.1450C生长实验:挑取CAC平板上翠绿色或蓝绿色菌落再次接种于CAC平板，恒温45℃培养48h，观察菌落生长情况。　　1.5.2革兰染色法取CAC平板上翠绿色或蓝绿色菌落涂片、固定后，革兰染色，置显微镜下观察。　　1.5.3PCR鉴定方法白色念珠菌的纯化及增菌:挑取CAC平板上翠绿色或蓝绿色单菌落划线接种于CAC平板上，重复3次。挑取在CAC上纯化的单个菌落移种于无菌沙氏液中培养，370C摇动培养24h0DNA提取:按照BiospinFungusUe-nomicDNAExtractionKit说明提取白色念珠菌DNA，收集菌液使用lyticase酶破细胞壁，蛋白酶K消化蛋白，RNase除去RNA，吸附柱法获得白假丝酵母菌的DNA，并用分光光度法测定DNA纯度和含量。于一200C冷冻保存备用。PCR扩增及电泳:引物1VI工TS:GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAGG;ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGAT-GCPCR。反应体系(20L);2XEasyTaqPCRSuperMixlOL,10mol/L上游引物和下游引物各0.5u，，牙菌斑DNA模板2.如L,H;O7.0L调制平衡。循环条件:95℃热启动5min;950C30s,500C退JC30s,720C30s,40个循环;72℃10min04℃保存。1.50%琼脂糖,1XTBE缓冲液，genefinder核酸染料染色，电泳(100V)30min。紫外线凝胶扫描成像，并记录实验结果。　　1.6统计学处理统计学处理采用SPSSl7.0统计软件对数据进行pearsonx检验、Kendall等级相关分析。检验水准为P<O.05。　　2结果　　2.1白色念珠菌临床菌株的培养白色念珠菌在37℃培养24h后在平板上形成白色或淡绿色扁圆形菌落，候菌落颜色呈翠绿色或蓝绿色，大小不一，直径1^-3mm，嵌人培养基，菌落表面及边缘光滑;紫色菌落为光滑念珠菌;蓝灰色菌落为热带念珠菌;粉红色菌落为克柔念珠菌;深绿色菌落为都柏林菌。　　2.245℃生长实验:培养平板经450C培养48h,生长良好。　　2.3白色念珠菌革兰染色，见图1显微镜下观察，可见成群革兰染色阳性的卵圆形抱子和假菌丝。　　2.4白色念珠菌PCR鉴定结果，见图2CAC鉴定培养基上呈绿色的菌落，经过PCR鉴定，均为白色念珠菌，目的条带明亮清晰。　　2.5维、汉民族，男、女性别的白色念珠菌检出分布情况见表2在总体样本中，汉族与维吾尔族白色念珠菌检出率分别为38.1%和24.300，两民族分布差异有显著意义(x=9.453,P=0.002);男性儿童中，汉族与维吾尔族白色念珠菌检出率分别为45.800,30.200，差异没有统计学意义(x=5.064,P一0.024);女性儿童中，汉族与维吾尔族白色念珠菌检出率分别为30.300,17.500，差异没有统计学意义饭2=3.43,P=0.064);总体样本中，男性儿童白色念珠菌检出率为40.50o，女性儿童白色念珠菌检出率为25.100，男性与女性分布差异有统计学意义(x=10.070,P=0.002);汉族儿童中，男性与女性白色念珠菌检出率为45.8%和30.3，汉族男女性别间分布差异没有意义(x=5.993,P=0.024);维吾尔族儿童中，男性与女性白色念珠菌检出率为30.2%和17.50o，维吾尔族男女性别间差异有显著意义（x=144.OOO,P=0.001).　　3讨论　　白色念珠菌广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性真菌。白色念珠菌近年来受到口腔微生物研究者的关注，不同地域，不同人群口腔白色念珠菌的分布的研究都有文献报道一吕1。在近十年的研究中发现龋齿损害部有时并没有变形链球菌的存在，口腔白色念珠菌与龋病的关系更是日益受到研究者的关注，很多学者认为白色念珠菌很可能是致龋的危险因素。Majewska等从54名年龄18^-28岁的健康人口腔中检出白色念珠的发生率与龋齿的发生呈正比关系。Rus-se11,C+二等认为白色念珠菌的检出率可能与年龄有关，随着年龄的增长，口腔内白色念珠菌的检出率会增高。而对比ECC组与无龋儿童组口腔白色念珠菌的检出率的研究中，MarchantS10和RadfordJR〕达成了ECC组比无龋儿童组口腔白色念珠菌检出率高的一致性。　　科玛嘉念珠菌显色培养基已得到临床和实验室的有效评价，Lisboa等二12二证实可依据CAC菌落颜色的差异，鉴别和分离培养不同念珠菌属。但都柏林菌在CAC:上也表现出淡绿或深绿色光滑菌落，与白色念珠菌在CA上很难鉴别。都柏林菌是199年Sullivan等〕首次从爱尔兰的HIV感染者和A工DS患者口腔中分离到的一种不典型白色念菌菌株.具有独特的流行学特征，在一般人群中少见，近年来有报道在非H工V人群中也可分离出都柏林念珠菌。为确定本次研究人群口腔白色念珠菌检出率的准确性，除对白色念珠菌和都柏林菌进行450C生长实验验证外，还运用灵敏可靠的聚合酶链式反应对白色念珠菌进行分子生物水平的鉴定，念珠菌ITS序列存在于高度重复的核糖体DNA中，是高度重复的串联序列单位，编码285,185,5.8S的基因，具有点内或位点间的协同进化。本研究采用MITS-IT52引物与白色念珠菌模板DNA特异结合，经过PCR鉴定，CAC鉴定培养基上呈绿色的菌落，经证明均为白色念珠菌。这也反映了CAC鉴定培养基的可靠性及提示应用CAC鉴定培养基可用于大规模的白色念珠菌的流行病学调查。　　本次研究针对新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市双语幼儿园3-5岁儿童进行口腔白色念珠菌的检出率调查，汉族儿童q腔白色念珠菌检出率38.100,维吾尔族儿童口腔白色念珠菌检出率24.30o，经统计维、汉民族间白色念珠菌检出率有显著差异，汉族儿童口腔白色念珠菌分布较维吾尔族儿童分布广泛，这在国内外还没有相关文献记载。而有文献报道汉族儿童的ECC患龋率及ECC龋均明显高于维族儿童，这也提示白色念珠菌与龋齿的发生可能具有一定关系。在白色念珠菌的性别分布差异研究中反映，汉族儿童男女性别检出无差异;维吾尔族儿童男女性别检出有差异;总体样本中男性与女性检出有明显差异。这些数据反映了儿童口腔白色念珠菌的总体分布可能与性别有关，与Ma'amonA的观点一致。龋失补指数(Dmft)可以反映个体的口腔龋病情况，在维吾尔族、汉族儿童口腔白色念珠菌检出与dmft分级的分布情况的研究中，获得的数据反映维吾尔族与汉族的ECC组白色念珠菌检出率较无龋儿童检出率高，这与MarchantS-"-,RadfordJR-"二的理论一致，且随着dmft分级增高，汉族与维吾尔族儿童的口腔白色念珠菌分布均与其成正相关的关系，提示白色念珠菌可能是龋病的危险因素。　　然而，白色念珠菌致龋的机制还不明确，其民族分布差异与民族间龋病发生率差异的关系仍有待深人研究，如维、汉民族儿童口腔中白色念珠菌的基因分型分布差异与龋病流行分布特征的关系，扩大对封闭式维吾尔民族聚集区的儿童进行流行病学调查与汉族儿童口腔微生物环境的对比等。　　参考文献　　　　SullivanDJ，WesternengTJ·HavncsKA, et al.  Candidadub-Liniensissp. Nov, phenotypic and molecular characterization ofa novel species associated with oral candidosis in HIV一infec-ted individuals[J].Microbiology, 1995, 141，1507一1521。　　秦振宇，吴绍熙，谭升一顺.等，都柏林念珠菌的国内首次分离[J].临床皮肤利一杂志，1999,2804):213一214。　　努尔比亚木.麦麦提依明，赵今.玛丽亚木古力，等.鸟鲁木齐市维汉两族儿童婴幼儿龋患病情况调查及相关因素分析[J}.中国循证医学杂志，2011,11(2):143-146