人牙龈间充质干细胞与牙周膜干细胞的性能比较

　　牙周病是危害人类口腔健康的重要疾病，目前　　可供临床选择的治疗方法都无法实现牙周组织生理性和功能性的完全再生。组织工程技术的出现和发展为牙周再生开辟了新的研究空间。种子细胞是组织再生的基础，因此是组织工程构建的关键，在牙周组织工程的研究中，牙周膜干细胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs)作为首选的种子细胞，已经得到广泛的认可[3]。然而，PDLSCS必需拔牙才能获得，大大限制了其临床应用的潜能。因此，寻求来源广泛、取材方便的细胞一直是牙周组织工程研究的重点和核心。在牙源性种子细胞中，同作为牙周组织来源的牙眼间充质干细胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)，近年来引起了学者的高度关注[5-V8=。本研究通过对同一个体来源的2种牙周组织干细胞进行对比分析，为GMSCs用于牙周组织工程研究提供实验数据。　　1材料与方法　　1.1主要试剂和仪器a-MEM培养基、青链霉素、L一谷氨酞胺(Gibco公司，美国);胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程有限公司);0.2500胰蛋白酶(Amresco，美国);I型胶原酶、维生素C、地塞米松、俘一甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红、油红O、二甲基亚矾DMSO(Sigma，美国);Dispase(Roche，美国);抗CD29、抗CD31、抗CD45、抗CD90、抗CD105、抗CD146、抗STRO一1抗体(R&DSys-terns，美国)。二氧化碳恒温培养箱(Thermo-Forma，美国);离心机(Kubota2100.日本);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂);倒置相差显微镜及照相系统(OlympusIX70，日本);体视显微镜(O-lympus，日本);6孔培养板、平底96孔板(Falcon,美国);lOcm直径细胞培养皿(Corning,Lowell，美国);流式细胞仪(BeckmanCoulter.Fullerton.美国);超声震荡仪(上海生源器械厂)，酶联免疫检测仪(BIO-TEK，美国);紫外线分光光度仪(Eppen-dorf，德国)。　　1.2原代细胞培养选取临床拔除第三磨牙时牙颈部连带少许牙跟组织的牙个体(或拔除第三磨牙后经患者同意切取少许的牙跟组织)牙跟成纤维细胞的原代培养:用PBS液体冲洗离体牙跟3-4次，用眼科小剪刀将牙跟组织尽可能的剪碎，离心，收集组织碎块，将3gjL的I型胶原酶和4gL的Disease以1，1比例加人并吹匀，放人370CO:培养箱中消化40min左右，加人等量的培养液中止消化，收集组织，接种于6孔板中，上置盖玻片，加少量含10%胎牛血清的a-MEM培养液放于370C,50oC0:的孵箱中培养，每2}-3d换液并观察。　　当细胞达到80%汇合时可消化传代牙周膜成纤维细胞的原代培养:用PBS液体反复冲洗离体牙3一4次，刮取根中1/3牙周膜组织，离心收集后加3g/I.的I型胶原酶和4g/L的Disease，以1，1比例混合均匀，放人370C,50oC02孵箱中消化15min,加等量含”%胎牛血清的。-MEM培养液中止消化，收集组织后接种于6孔板中，置盖玻片。加少量含10%胎牛血清的。一MEM培养液置于37℃、50oC0:的孵箱中培养，每2-3d换液并观察，当细胞80%汇合时消化传代。　　1.3有限稀释法克隆分离GMSCs和PDI_SCsGMSCs和PDLSCs的克隆分离方法基本相同。取对数生长的第1代上述细胞，消化后制成单细胞悬液.将其稀释为10-v15个细胞//mI，接种于96孔板中，每孔0.1m工，保证每个孔不多于1个细胞，常规培养24h，待细胞贴壁后在显微镜下挑出单个细胞孔并标记，补加0.1mL培养基，每隔3d大半量换液。当孔内细胞形成克隆集落并长至孔底1/2后，胰蛋白酶消化，扩大培养，即得到相应的GMSCs和PDLSCs。　　1.4细胞克隆形成能力的比较取对数生长的第4代细胞，制成单细胞悬液，将1X103个细胞接种于lOCM的培养皿中常规培养14d。弃培养液，PBS浸洗2遍，4%多聚甲醛室温固定，PBS漂洗后，甲苯胺蓝染色，镜下观察。以大于50个细胞的集落记为一个克隆。计算比较两种细胞的克隆形成率(colonyformingunit一fibroblastic，CFU一F)。公式如下:克隆形成率一细胞克隆形成数/接种细胞数X100%。　　1.5MTT法比较两种细胞的生长曲线分别取GMSCs和PDLSCs的第4代细胞制成单细胞悬液，细胞均匀接种于96孔板中，每孔接种1.5X103个细胞，置于370C,50oC02孵箱中常规培养，每2d换液1次预测8d的吸光值，每天为一组，每组设5个复孔。将配置好的Jg/工、的MTT液避光保存，分别在接种后的第1,2,3,4,5,6,7,8d的同一时间点在相应组的每孔中加20}LMT"I'液，于4h后吸去培养液，加150二甲基亚矾，振荡器低速震荡10min后用酶联免疫检测仪测490nm处的吸光值，绘制生长曲线并比较。　　1.6流式细胞仪检测干细胞表面标志物分别取对数生长的第4代细胞，制成单细胞悬液，并将密度调整为1X106/mL。用含3%的胎牛血清的PBS洗净后分装人EP管中，加人适当量的抗体STRO一1、CD146,CD90、CD105、CD29、CD31、CD45，放4℃冰箱中孵育1h候后用含30oFBS的PBS洗去抗体，送流式细胞仪检测，操作过程需避光。其中STRO-1是A1exaFluor647标记，CD105,CD29,CD146,CD90,CD31为PE标记，CD105,CD29为FITC标记。比较两种干细胞对相应抗体的表达率。　　1.7两种细胞骨向分化能力的比较分别取第4代的GMSCs和PDLSCs，制成单细胞悬液调整密度为5X10"个/mL，接种于6孔板中，当细胞长至5000^60%时，换成骨诱导液(含5mmol/L(3一甘油磷酸钠、50mg/I维生素C,1X10一0mol/L地塞米松、100oFBS的。一MEM培养液)培养，每2一3d大半量换液，培养至28d时，镜下观察可见细胞呈复层生长并出现圆形结节，弃培养液，PISS浸洗后4%多聚甲醛固定.茜素红染色，镜下观察并照像。之后用氯化十六烷基毗陡溶液溶解骨化结节，用酶联免疫检测仪测540nm处吸光值比较2种干细胞形成骨化结节的量。　　1.8两种细胞脂向分化能力的比较分别取第4代的GMSCs和PDLSCs，制成单细胞悬液后调整细胞密度为5X10a/mL，接种于6孔板中，当细胞长至80%一90%时换成脂诱导液(含1}mol/工、DEC,0.5mmoljI_IBMX，10rng/I_BPE，100mmol/IIndomethacin,100oFBS的。一MEM培养液。每2-3d大半量换液，培养至21d时镜下观察可见脂滴形成，弃培养液后浸洗，多聚甲醛固定.油红染色，镜下观察并照相。将异丙醇溶液加人6孔板中，待脂滴溶解后，测540nm处吸光值比较两种细胞脂滴形成量。　　1.9统计学分析使用SPSS17.0软件进行统计分析，两组独立样本均数比较用t检验，检验水准。　　2结果　　2.1两组细胞的分离和培养牙跟来源细胞原代培养7d左右可见有牙酿成纤维细胞从组织块周围爬出，大多数为长梭形，有细胞突起，胞核居中，一般经过2周左右，细胞可达80%汇合，见图1a牙周膜来源细胞原代培养10d左右可见牙周膜细胞从组织块周围爬出，细胞多数为长梭形，有细胞突起.细胞核居中，多数经2}-3周细胞可达80%汇合，见图1。　　2.2两组干细胞克隆形成率的比较GMSC、平均5d左右形成克隆集落.PDI_SCs平均7d左右形成克隆集落，可见细胞集落呈旋涡状生长，集落内细胞密度随时间逐渐增加，细胞形态为长梭形，细胞突起明显，见图20l4d时甲苯胺蓝染色，计算克隆形成率。GMSC、和PDI_SCs的克隆形成率分别是5士3.2<12.9士0.6。经统计学分析，两者之间具有显著性差异(PLO.05)，见图302.3两组干细胞生长曲线的比较MTT结果示GMSCs和PD工SCs都有较强体外扩增能力一9，，从第3天开始GMSCs的增殖比PDLSCs明显要快，两种干细胞的生长于第8天时进人平台期，见图4。GMSC、和PDLSCs从第3天开始增殖能力的差异具有统计学意义(PLO.05)2.4细胞表面标志物的表达通过流式细胞仪检测，UMSCs和PDLSCs的表面标志物表达相似，对造血系标志物CD45和内皮系标志物CD31表达均成阴性，而对干细胞特异性标志物STR()一1,CD146,CD29,CD90,CD105表达阳性，见图5。GMSC、的表面标记物表达如下:STRO-1是16.300%，CD146是55.200，CD29是1000a，CD90是99.900，CD105是9700，CD45是1.900，CD31是1.30o;PDLSCs的表面标志物的表达如下:STRO2.两组细胞成骨能力比较成骨诱导培养至28d时镜下观察见，细胞成复层生长，部分细胞聚集成圆形小结节状，弃去培养液，PBS清洗2一3遍，400多聚甲醛室温固定30min后再次清洗，茜素红染色，PBS浸洗2-3遍后镜下观察照相，见图6。用氯化十六烷基毗咤脱茜素红在X40nm处测吸光值，通过A值比较2种干细胞的成骨分化能力，两组细胞具有显著性差异(PLO.05)，见图702.6两组细胞成脂能力比较成脂诱导培养至21d时，镜下观察细胞成复层生长，并有圆形小空泡形成，弃去培养液.PPS浸洗2一3遍后，4%多聚甲醛室温固定30min，再次浸洗，油红O染色，镜下观察拍照，见图8。用异丙醇洗脱油红O，在540nm处测吸光值，统计比较两种细胞的成脂分化能力，两组细胞无统计学差异，见图9。　　3讨论　　随着PDLSCs的发现，越来越多的证据表明PDLSCs具有良好的牙周组织再生潜能。Aki-zuki等通过细胞膜片技术利用PDLSCs成功修复了犬下领骨缺损模型，并观察到新生的牙槽骨、牙骨质、牙周韧带等复杂结构。随后，首都医科大学工松龄教授课题组在小型猪牙周炎动物模型中，利用自体或异体PDLSCs，均实现了牙周组织的生理J比和功能性再生。但是PDLSCs的来源有限，给实验设计及临床治疗均带来了不同程度的困难。而同是牙周组织来源的GMSCs，也有实验利用其有效修复了裸鼠下领及颅骨缺损，证明了GMSCs的体内成骨能力贝。虽然有关GMSC、的研究还处于初级阶段，已有证据表明GMSC;s比起具有更好的干细胞性及下细胞稳定性，提示GMSCs在自体及异体细胞治疗中具有广阔的研究前景和开发空间仁3几，巨具有取材方便，易培养的优势。　　本实验通过对GMSCs和PDLSCs的增殖及分化能力的比较，发现GMSCs具有较强的增殖能力，这可能是造成牙眼组织能够无疤愈合且愈合能力强的基本原因。两种干细胞对干细胞早期标志物STRO-1和CD146均成阳性表达，同时高表达其他干细胞标志物如CD29,CD90,CD105，而对造血系标志物CD45及内皮系标志物CD31均不表达。　　结果表明，两种干细胞对阳性标志物的表达率并无统计学差异。通过体外克隆形成率的比较，GMSCs的克隆形成能力要高于PDLSCs，说明其克隆增殖能力要强。在体外诱导环境下，GMSCs的成骨能力要弱于PDLSCs，但其成脂能力稍强。这一现象与既往文献中报道的干细胞成骨能力增强其成脂能力降低的特点相吻合。　　本实验结果表明，GMSCs和PDLSCs的干细胞性能具有一定的差异。GMSCs能否和PDLSCs一样具有良好的牙周组织形成能力，能否作为牙周组织工程的候选种子细胞，需要进一步深人研究。　　参考文献　　郑巍.王石.工GF-1对人牙周膜干细胞增殖能力的影响[J].口腔医学研究.2012，,2（1）:77一79　　Gronthos S, Mrozik K, Shi S, et a1.  Ovine periodontal ligawent stem ce11s: isolation, characterization, and differcntiation potential [J].  Calcif Tissue Int, 2006,79(5):310一317