人羊膜对牙槽骨拔牙窝植骨影响的实验研究

　　牙槽骨缺损是口腔临床常遇到的问题，如牙槽突裂，牙周病及牙种植，均涉及到牙槽骨骨量不足，这问题一直是临床医生研究的热点之一。引导骨再生(GBR)技术的出现已有效解决了这一问题，有学者将GBR和(或)骨移植联合修复骨缺损取得了理想效果。骨移植可修复牙槽裂，解决牙周及牙种植骨量不足，但是骨移植修复缺损后常常出现移植骨吸收、感染及坏死，创口裂开，移植骨外露等并发症，未能使骨缺损区恢复足够的骨量，导致手术失败。降低骨再吸收，提高骨保有量是手术成功的关键，也是临床医师一直探讨的热点。羊膜作为一种生物材料应用于基础及临床已以得到广泛应用，目前尚未见羊膜对牙槽骨植骨影响方面的报道，本研究通过对兔拔牙窝自体骨移植，植骨面进行羊膜移植，探讨羊膜对牙槽骨植骨的影响。　　1材料与方法　　1.1植人材料及设备生物羊膜(江西生物瑞济生物工程技术有限公司)，HEINE手术放大镜(德国海尼公司),Finesse325轮转切片机(广州攀俊市医疗器械有限公司)，OlympusCX31显微镜(lym-pus公司)。　　1.2实验动物及分组12周龄本地白兔(由南昌大学动物科提供)，体重1.5-}-2.0kg，共12只·A组随机选取6只，拨除右侧上领第1,2前臼齿，拔牙窝使用牙眼覆盖，再将12只兔随机分为B,C组，拨除左侧上领第1,2前臼齿，B组行自体肋骨移植牙眼覆盖，C组行自体肋骨移植+羊膜牙眼覆盖(牙跟剔除骨膜，避开对实验结果的影响，更好地监测羊膜的作用)。行双侧手术的同期进行，即A,B,C组每组6侧。　　1.3方法　　1.3.1手术方法及标本的制取采用10-}-15mg;kg氯胺酮肌注全麻，常规消毒铺单，自制开口器开口，先用口腔探针分离第一、二前臼齿牙跟，再用牙跟分离器挺松前臼齿，乳牙钳拔除，拔牙窝大小约4.0mmX3.}mm,A组拔牙后松解牙跟直接缝合。　　B组则在A组的基础上.切取右则第8肋骨长约2.5^-3.5cm，并将肋骨剪成。.5^-1.0mm大小颗粒状，迅速植人拔牙窝，并稍压紧植人的骨颗粒。填至牙槽晴平齐，最后缝合牙跟oC组则在B组基础上再剪取一块大小约5.0mmX4.5mm羊膜覆盖植骨面，周边位于牙跟下方.四周8一0缝线叠瓦状缝合固定于牙眼，再将两侧已刮除骨膜并松解的牙眼缝合关闭创面。双侧手术的同期完成。所有手术全部由一人操作术后抗炎治疗3d,12周处死，1000甲醛溶液中固定制取标本。　　1.3.2大体观察肉眼观察A,B,C组上领第一、二前臼齿拔牙创牙酿及牙槽骨愈合情况。　　1.3.3X线摄片观察及测量将所有上领骨标骨从正中矢状锯开，分组编号，全部平铺，在同一张X线片普通摄片，X线投射参数为:42kV,200mA,O.　　08s,30cm。进行X线分析，观察各组牙槽骨成骨情况，骨密度，骨量及外形。并进行X线数字射影，用pacs3.0系统进行测量，测量拔牙创改变高度，自第一、二前臼齿牙槽峭最低点画一平行于正常牙槽岭的直线，两平行线之间的垂直距离即为拔牙创改变的高度。　　1.3.4组织学观察及测量所有兔头颅标本固定后，经脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋.切片，行HE染色等制片。然后进行组织学观察，观察骨小梁成骨J晴况。计算牙槽峪创面新生骨面积百分比。每张切片均在10X10视野下选取拔牙创内外侧正中位置植骨面表面水平方向的连续5个视野，将10X10计数方格(方格大小1mm)的一边与创面表面平行接触，其它部分与创面下方骨髓腔接触，计算骨小梁的面积比。新生骨面积百分比:新生骨骨小梁的面积百分比一新生骨小梁所占的方格面积/方格总面积。最后取三个视野下骨小梁面积的平均值。　　1.3.统计学处理将测量数据采用spssl3.。统计软件进行单因素方差分析及工_SD检验，比较各组显著性差异，YGO.0}为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1大体观察所有标本拔牙创均已牙龋覆盖，创面愈合良好，无感染裂开，无牙槽骨外露拔牙窝均己愈合A组牙槽蜻部分新生骨样组织隆起，表面凹凸不平，点状小坑，不光滑，大量纤维结缔组织，与牙眼组织粘连，难以剥离，B组牙槽靖见新生骨样组织，见表面稍粗糙，少量纤维结缔组织，牙酿组织少量粘连.可剥离，C组羊膜均已吸收，牙槽峙表面光整，纤维结缔组织不明显，牙酿组织少许粘连，易剥离.但较正常牙跟粘骨膜覆盖稍困难，见图to2.2X线摄片分析　　2.2.1牙槽骨X线片观察A组:牙槽密度不均匀，部分骨质硬化，牙槽靖不光整，部分有中断现象。　　B组:牙槽骨质硬化明显，见少量小片状低密度区，牙槽岭不光整、毛糙。C组:牙槽骨质硬化明显，仅见点状低密度区，牙槽晴光整、连续，见图1.　　2.2.2拔牙创改变高度经统计学分析，3组拔牙创改变高度C组<B组<A组(表1，则说明术后12周3组牙槽峭剩余高度C组>B组>A组。　　2.3组织学观察　　2.3.1HE染色结果拔牙创面骨痴:A组:牙跟覆盖组见创面骨痴未融合成块，骨小梁纤细，骨量少，间质胶原纤维疏松，见破骨细胞，大量毛细血管;B组:植骨牙眼覆盖组见骨痴融合成块覆盖创面，骨痴薄，骨小梁排列紊乱，胶原纤维穿插其中，见散在骨颗粒，见破骨细胞，少量毛细血管;C组:植骨羊膜牙跟覆盖组，骨痴融合成块覆盖创面，骨痴厚，骨小梁宽大、排列规则，胶原纤维致密，未见散在骨颗粒，未见破骨细胞，见图2一图7.　　3讨论　　人羊膜是从细胞滋养层衍化而来，是两层胎膜的内层。表面光滑，半透明，有韧性及弹性，无血管、神经和淋巴管，厚度为0.02-0.05mm，是人体最厚的基底膜。羊膜不表达HLA-II类抗原，抗原性极低，用于异体移植时一般不产生排斥反应咬。羊膜作为一种特殊的生物材料，具有抗微生物的特性，降低术后感染，保护创面，促进创面愈合。口腔领域将羊膜用于溃烂面覆盖、牙眼缺损修补、前庭豁膜修补、愕部硬软组织缺损修补工及与瓣联合用于口腔组织重建，取得了一定成功。本这实验首次将羊膜运用于牙槽骨，观察羊膜对牙槽骨植骨的影响。　　大体标本观察实验羊膜组拔牙创未出现红肿感　　染化脓症状，愈合良好，也未出现排次反应。羊膜组牙槽骨表面光整，纤维结缔组织较牙眼覆盖组及植骨牙跟覆盖不明显。本实验之所以选用羊膜，在于应用它的抗微生物，降低术感染作用，抑制纤维化作用，促进细胞的迁移和增殖功能,羊膜主要由羊膜上皮和羊膜间充质两类细胞组成.羊膜间充质细胞((hAMCs)主要分泌工型和m型胶原蛋白、层粘连几蛋白和纤维结合蛋白。hAMCs表面标志与骨髓间充质干细胞相似，都表达典型的间充质细胞标志。羊膜间充质细胞可向软骨细胞分化，表达软骨特异性的II型胶原蛋白X13。最近Alviano等1}},Soncini等仁1.}-,报道可诱导hAMC's分化成软骨细胞。有学者诱导hAMCs向成骨细胞分化，检测到成骨细胞特异性碱性磷酸酶的表达和钙盐沉积现象r16-,。以上报道了hAMCs具有分化成软骨及成骨细胞的潜能，研究表明hAMCs有望成为骨及软骨组织工程种子细胞新的来源.　　VishwaKarma在其动物实验二19;及范家伦等在髓关节成形术后活检均证实植人羊膜可化生纤维软骨、透明软骨。本研究C组兔拔牙窝行自体肋骨移植，并于植骨面覆盖一层羊膜，隔离软组织对植骨的影响，术后12周测量C组拔牙创改变高度最低，创面新生骨骨小梁宽大，骨小梁面积百分比最大，成骨量最多，同样也表明羊膜有成骨及成骨引导作用。　　实验A组拔牙窝的愈合有4个阶段:拔牙创出血和凝血块形成，凝血块机化，骨组织的修复及上皮覆盖拔牙创。实验A组经过血凝块机化成骨。实验B.C拔牙窝行自体肋骨移植。自体骨移植无抗原性及排斥反应，为骨缺损区提供了一定数量的成骨细胞，并且为骨生长提供支架材料，疗效最肯定，被认为骨缺损修复的金标准。本实验采用的是兔自体肋骨颗粒骨移植，属于单纯游离骨移植，单纯游离骨移植的愈合即植人骨逐渐被吸收，新牛骨逐渐长成。愈合过程中，在显微镜下可见移植骨处有较多的破骨细胞及成骨细胞聚集，并不停地吞噬骨块组织和再造新的骨组织，直到最后新的活的骨组织完全代替植人的骨块组织，但是移植骨可发生部分或完全吸收。本实验B,C组采用兔自体肋骨颗粒骨移植，无排斥反应，排除干扰因素，使手术可行性更大。给宿主成纤维细胞、成骨细胞提供了直接细胞长入框架，引导细胞快速长人，减少或缩短血凝块机化期，直接进人骨形成期。　　本实验结果X线观察羊膜组牙槽骨质硬化较其它2组明显，仅见点状低密度区，牙槽峪光整、连续。组织学观察羊膜组骨小梁较其它2组宽大，创面骨小梁融合成块并覆盖创面。表明羊膜组牙槽骨成骨效果更好。主要考虑以下几点:首一先是羊膜覆盖植骨面起屏障作用，隔离植骨面外周软组织牙跟的直接接触，避免牙耀释放出部分生物因子干扰成骨过程，其次羊膜组织作为一种生物支架，作为骨细胞载体，引导骨组织再生，最后羊膜的直接成骨作用。本实验选在拔牙窝植骨，拔牙窝四周有骨壁支持，牙槽内外两侧有骨膜存在，与牙槽骨的常见缺损有区别，如牙槽裂内外侧缺乏骨及骨膜的支持营养作用。有关羊膜在牙槽骨缺损的临床实际应用的差异需进一步探讨。　　本实验组行羊膜移植，主要利用羊膜的支架骨传导作用，及hAMCs分化成软骨及成骨细胞的成骨作用。实验结果表明，兔拔牙窝牙槽骨植骨，植骨面行羊膜移植，能促进骨的愈合，减少骨的吸收，可作为GBR技术可供选择的屏障膜之一。羊膜是胎盘内膜，人生产后胎盘被丢弃，不存在伦理学问题。　　但目前市场生物羊膜的价格昂贵.临床羊膜的应用应结合患者经济条件，为患者做出最佳选择。　　参考文献　　Lawson VG.  Oral cavity reconstruction using pectoralis ma-jor muscle and amnion [J].  Arch Otolaryngol, 1985.111(4):230一233　　Kesting MR,  Loeffelbein DJ,  ClassenM，et al.  Repair oforonasal fistulas with human amniotic membrane in minipigsr[J].Br J Oral Maxillofac Surg, 2009，1一5