化疗前后Caspase-3和P73在颊粘膜鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
发表时间：2014-07-30 浏览次数：1004次
目前致癌基因变化的研究已由单一基因发展到对多基因协同作用和相互调节机制的研究阶段,对口腔粘膜鳞状细胞癌的癌变过程中的多种分子标志物进行研究,将有助于提示口腔粘膜鳞状细胞癌的早期癌变机理,提高早期诊断和治疗水平.天冬氨酸特异的半光氨酸蛋白酶(Caspase)是细胞调亡的核心机制,其级联反应的激活决定了凋亡发生的进程。P73是一种癌基因,它原发的表达水平升高可刺激肿瘤的生成,为了探讨Caspase-3和P73的异常表达对于颊粘膜癌发生的意义,本实验应用免疫组织化学法和流式细胞术(FCM)荧光定量分析技术对二者在颊粘膜鳞状细胞癌中的表达量进行了研究,并对其表达在应用奥铂和替加氟化疗前后进行了分析比较
资料与方法
1.选取2007年至2010年在河北医科大学第四医院口腔科初诊的30例颊粘膜鳞状细胞癌患者为实验对象,男性18例,女性12例,中位年龄48岁。标本取自术前活组织检查和手术标本,结果均由病理学证实。另取10例颊粘膜良性肿瘤患者的正常粘膜(距离肿物边缘0,125px),4%甲醛固定,4℃保存。
2.免疫组织化学:标本4um厚连续切片,采用S_P方法,3.3’-二氨基联苯胺(DAB)染色。操作步骤参照试剂盒说明书进行。结果判定:免疫组化染色阳性反应为黄~棕色颗粒且明显高于背景颜色。在病变处选取10个高倍镜视野(×400),每个视野计数1OO个细胞数,按阳性细胞所占的百分比分为:无标记阳性细胞或阳性细胞数≤50%者;(+)阳性细胞数硝。由2位有经验的病理医师在未知患者任何临床资料的情况下,采用双肓法进行阳性细胞计数。
3.单细胞悬液制各采用网搓法,首先将组织进行水化,依次100%、20%、20%、50%乙醇中10分钟,最后放入双蒸水中10分钟。水化后将组织放在平皿上120目不锈钢网上用眼科剪将组织剪碎,用眼科镊子轻轻搓细胞块,边搓边用生理盐水冲洗,直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块,收集细胞悬液,以800转/分离心沉淀3分钟.取0.111al(1×10D细胞加人一抗100耐,室温放置30分钟,继续加入二抗,室温下避光放置30分钟,上机检测。
4.流式细胞仪检测条件及分析方法:采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-ⅩLII型流式细胞仪,激发光源为15mw氩离子激发器,激发波长为488nm,检测前以荧光微球作为标准样品调整仪器CⅤ值在2.0%以内。蛋白表达定量分析以荧光指数(FI)表示,它们的相对含量公式为:Π=[样品蛋白的平均荧光强度(均道值)y[正常对照样品平均荧光强度(均道值)],如果FI>1,0为阳性表达,FI≤1.0为阴性表达。
5.统计学处理:应用SPSS12.0统计软件行检验、精确概率法和bllmmall等级相关分析。
结果
1.CaspaseJ和P73在颊粘膜鳞状细胞癌组织和正常黏膜中的表达情况(图1、2):Caspasc-3阳性物质见于癌细胞的细胞浆,个别在细胞核,它在正常黏膜中可完全表达c化疗前颊粘膜鳞状细胞癌中表达阳性率为⒆.6±2.75%,化疗后为83,96±3,37%,正常组为9853±1,08%(P(0.05);P73蛋白在颊粘膜鳞状细胞癌中为高表达,与正常组组织比较表达量升高20~30%,奥铂和替加氟化疗后表达量有所下降,与正常组织比较仍有差异。
2.Caspase~s和P73蛋白表达量在颊粘膜鳞状细胞癌化疗前后的比较(表1):Caspaqe3蛋白在颊粘膜鳞状细胞癌中为低表达,与正常组比较表达缺失30-Z10%。奥铂联合替加氟化疗后有所回升。P73蛋白在颊粘膜鳞状细胞癌中为高表达,与正常组比较表达量升高20~30%,奥铂联合替加氟化疗后表达量有所下降,与正常组比较仍有差异。
讨论
口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔最常见的恶性肿瘤,约占口腔全部恶性肿瘤的80%以上,占全身恶性肿瘤的3%~5%田。颊粘膜鳞状细胞癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,与细胞的增殖、基因改变和调亡平衡调节失控有关。
本实验以正常粘膜做对照,对Casp猫c-3和P73在颊粘膜鳞癌应用奥铂联合替加氟化疗前后对进行了定量分析,发现二者在癌细胞中表达异常。药物治疗后恢复或接近正常,说明奥铂联合替加氟对癌细胞的生长起到了控制作用,并有使癌细胞向正常细胞转化的可能性。也说明对Caspase3和P73的定量分析是一个较理想对肿瘤早期诊断和治疗的标志物。
目前认为细胞内所发生的与凋亡有关的一系列有序的级联反应,关键是激活一组ICE、CED-3的关键酶类,因它们均具有半胱氨酸和天门冬氨酸裂解位点,又称Caqpasc。因其在凋亡过程中的重要作用,被誉为“凋亡步兵”或“凋亡刽子手。新近研究发现,在肿瘤坏死因子TNF_α(诱导产生的凋亡中,谷氧还蛋白GrⅩ(αutared。疝n)调节着Caspase-3的分裂和激活。Caspase-3主要分布在胞浆,少数在胞核,在不同的细胞类型中选择性的表达。研究表明,Caspase-3在肾癌刨、前列腺癌□、肝癌驯等组织中表达量较正常明显降低。本实验发现颊粘膜鳞状细胞癌组织中Caspase-3的表达明显降低,与口腔正常黏膜的表达量比较差异有显著性,经奥铂联合替加氟化疗后Caspase-3的表达有所回升,因此,Caspase-3表达检测可用于口腔粘膜癌前病变恶变潜能的监测,但其机理有待于进一步的深人研究。
P73基因定位于1P36933,该区在许多人类肿瘤如神经母细胞、恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肝细胞癌等发生缺失的频率非常高H。由于l,T3与l,D^3的DBD和OD区具有较高的同源性,P53靶基因(如CDKNIA/l,21、MDM2、BBC3/PUMA、PMAIP1/NOⅩA和BAⅩ等)也受到`3的反式调控Ⅱq3当PT3过表达时,可以与b3相似的方式来诱导细胞调亡,从而抑制SAOS2和BHK(bobyhamster kcllley)两个细胞株的生长,P53不像P73一样在肿瘤组织中有很高的突变率。P73在正常组织中为低表达;而在肿瘤组织中则常为高表达。而且高表达的P73基因尚未发现有基因突变现象作为基囚组卫士,在DNA受操作时迅速增加,活化转录因子,且其增加的水平与DNA损伤程度成正比。而P73基因则不被放线菌素D和紫外线辐射所激活Ⅱ勾。根据实验结果,我们认为,P73在口腔颊粘膜癌状细胞癌癌变过程中发挥着重要作用。P73在口腔粘膜癌变过程中表达逐渐增加,提示P73参与粘膜癌变的发生与发展。同时由于同源性,可结合并活化某些3靶基因的活性。故在P73缺失组织中以P73代替P53行使功能,诱发肿瘤细胞凋亡;是肿瘤基囚治疗的一个新方向。
综上所述,作者认为检测Caspe-3和P73在OSCC组织中的定量表达有一定的临床意义,可以对OSCC的发病机理、早期诊断、治疗及判断预后提供重要的证据c
