不同冲洗剂冲洗根管杀菌效果的体外观察

臭氧水溶液因具有较强的抑菌、杀菌能力和较低的毒性，近年来在口腔医学领域中的应用日益广泛，但作为冲洗剂在根管治疗中的应用尚处于基础研究阶段。E.faecalis是导致根管治疗失败及难治性根尖周炎的主要致病菌[1-2]。本实验通过建立离体牙的E.faecalis体外感染模型，采用稀释平板计数法测定经冲洗剂处理后各实验组每毫升中的菌落形成单位(Colony Forming Units，CFU)，比较臭氧水溶液的杀菌能力，为臭氧水溶液应用于临床感染根管的冲洗提供微生物学基础。

1材料与方法

1.1材料：粪肠球菌ATCC 29212(吉林大学口腔医院)

1.2仪器：超净工作台(YJ-875DA型，苏静集团安泰公司制造)、恒温细胞培养箱(MEMMERTCO，France)、倒置显微镜(CK2TRC-3 Olympus，Japan)、Gilson加样枪(USA)、XW-80A旋涡混合器(上海仪器厂)、电热手提高压消毒器(上海通用核子仪器)、紫外光分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)、P5超声震荡仪(Dentsply，USA)、Mtwo机用镍钛器械(VDW，Germany)、不锈钢K-File(Dentsply，USA)、灭菌纸尖(Dentsply，USA)等。

1.3试剂：BHI培养基(山东青岛海博生物公司)、FiltekTMP90(3M ESPE，USA)、5.25%NaCl溶液(长春宝泰克)、15%EDTA(Dentsply，USA)等。

1.4方法

1.4.1粪肠球菌的培养：将E.faecalis冻存液常温下复苏，取50μl菌液接种于灭菌的BHI固体培养基中，37℃恒温箱中厌氧培养48 h。采用革兰染色、光镜下形态学检查确认E.faecalis的培养纯度：该菌为革兰阳性肠球菌，呈圆形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，无运动特性，单个、成双或短链排列(见图1和图2)。

1.4.2离体牙的选择和标准化：选择根尖发育完成的单直根管离体牙30颗，全部进行X线检查(确保无隐裂等情况)。清理牙齿外表面后，浸泡于4℃生理盐水中保存备用。取备用离体牙，去除牙冠，牙根统一成标准长度10 mm。拔除牙髓，不锈钢K-File通畅根管，15%EDTA辅助超声荡洗根管2 min，然后用蒸馏水冲洗1 min，Filtek P90行根尖封闭。

1.4.3感染模型的建立：所有标本置于BHI液体培养基中，高温高压(121.3℃、1 MPa)灭菌20 min。37℃恒温厌氧培养48 h，观察培养基透明说明灭菌可靠。利用紫外分光光度计调整菌液浓度，使E.faecalis单克隆菌液在波长600 nm处的混浊度OD=0.5 Abs，在超净台中，每个样本注入200μ该混浊度的E.faecalis菌液，于37℃恒温箱中厌氧培养至21 d。至此，体外感染模型建立完成(见图3)。

1.4.4感染根管的处理及取样：所有样本随机三等分：组1(3.994 mg/L臭氧水溶液[3])、组2(1.339 mg/L臭氧水溶液[4])、组3(5.25%NaCl溶液)。石蜡包埋在无盖塑料容器中(见图4)，按下颌牙位操作：在无菌条件下，不锈钢K-file畅通根管，Mtwo机用镍钛器械预备根管至35号，每更换一号器械，均进行冲洗，冲洗时间1 min，冲洗剂量3 ml。冲洗时，注射器针头尽量深插，以无阻力、不嵌塞、回流通畅为标准，同时上下、左右移动针头。每颗牙冲洗结束后，即刻用5 ml无菌蒸馏水冲洗根管，静置1 min。分别于根管冲洗前、后，选取合适的无菌纸尖插入根管内，至根尖孔处，保持纸尖与根管壁相接触，停留1 min。

1.4.5细菌的鉴定：每组各随机抽取2例Eppendorf管中0.1 ml的液体接种于BHI上，根据菌落形态，通过革兰染色确定无其他微生物生长，具体鉴定方法同1.4.1。

1.4.6稀释平板计数：于超净台中取出灭菌纸尖，立即放入装有0.5 ml无菌BHI液体的Eppendorf管中，振荡混匀1 min。将此培养液进行10倍系列稀释，具体操作步骤如下：取6个灭菌的Eppendorf管并编号，每管中加入900μl无菌蒸馏水;向管1中加入E.faecalis悬液100μl，用XW-80A旋涡混合器振荡2～3次，混合均匀;然后，从该管中吸出100μl，加入管2中，如上操作，直至管6。取无菌平皿3套，从管6开始，滴平皿取样计数，每个试管取20μl，对号加入平皿中至管4止，每个平皿取3个样，取均值以提高实验精度。待平皿中的液体干燥后正放入37℃恒温箱中培养至所需时间后，取出培养平板，计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数，按下列公式计算各实验组的CFUml-1。CFUml-1=同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数×5。

1.5统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件，分别对三个实验组的菌落形成单位进行成组设计的两样本非参数检验(Mann-Whitney U检验)。

2结果

根据表1、表2和表3示：冲洗前各组根管内细菌数量的差异无统计学意义(P>0.05)。经冲洗剂处理后，培养24 h各实验组对根管内E.faecalis的杀灭率均为100%，7 d时均有少量E.faecalis被检出，但三组之间无统计学差异(P>0.05)，表明三种冲洗剂对根管内的E.faecalis均有瞬时杀灭作用，但却不能完全将其清除，只能减少它的数量，使其在一段时间内处于抑制状态。此外，表3还说明臭氧水溶液的杀菌能力与其浓度呈正相关。

3讨论

本实验采用平板计数法，将待测样本经10倍系列稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落。即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的细菌数。该计数法的缺点在于操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能进行计数，但是稀释平板计数法最大的优点是能够较准确地反映残存的活菌数。E.faecalis是导致根管治疗失败及难治性根尖周炎的主要致病菌，最高检出率可达77%[2]。E.faecalis是人体的正常菌群，属于条件致病菌，寄居于人类的肠道、泌尿生殖器官和口腔。该菌为革兰阳性兼性厌氧菌，呈圆形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，无运动特性，能产生应激性蛋白以适应葡萄糖缺乏、环境温度升高等改变，还能在碱性环境中利用质子泵维持自身酸碱平衡，对抗不利的碱性抑菌环境，在根管内主要以生物膜形式存在，临床医师很难用传统的治疗方法将定植于根管中的E.faecalis彻底清除[5]，而且E.faecalis繁殖能力强，易于侵入牙本质小管，对青霉素、头孢菌素、林可霉素、强力霉素等大部分抗菌剂有耐药性[6]，并可在一定程度上耐受宿主体内的非特异性免疫应答[7]。鉴于上述特点，E.faecalis已成为近年来微生物学及牙体牙髓病学和牙周病学等多领域研究的热点。根管冲洗对根管系统的消毒和清理起着重要作用，是因为根管系统的复杂性，单纯的器械预备达不到彻底清理根管系统的目的，必须辅以冲洗液的机械或化学作用来达到。因此，根管冲洗是根管预备过程中必需的环节。目前常用的根管冲洗剂在抗菌能力、清洁作用和组织相容性等方面综合考虑各有优缺点。因此，寻找一种新的理想的根管冲洗剂成为牙髓病和根尖周病临床研究的一个重要任务。臭氧水溶液因具有较强的抑菌、杀菌能力和较低的毒性，近年来在口腔医学领域中的应用日益广泛，但作为冲洗剂在根管治疗中的应用还处在基础研究阶段。目前大多数学者认为臭氧的杀菌机制：①氧化分解胞浆内的GPDH，影响细菌糖酵解途径，阻断细菌能量来源，从而使细菌的物质代谢和生长繁殖过程遭到破坏;②通过渗透作用侵入菌体内部，直接作用于细胞膜的外壳脂蛋白和内面的脂多糖，使细胞发生通透性畸变，胞内物质外流，导致细胞的溶解死亡。但还应注意：臭氧不稳定，易分解为氧而降低杀菌强度，因此临床应用时，必须使用新鲜制取的臭氧水溶液。

4参考文献

[1]Elkarim I，Kennedy J.The Antimicrobial Effects of Root Canal Irrigation and Medication[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol，2007，103(4)：560.

[2]Matos Neto M，Santos SS，Leao MV，et al.Effectiveness ofthree instrumentation systems to remove Enterococcus faecalis fromroot canals[J].Int Endod J，2012，45(5)：435.

[3]高爽.臭氧水溶液冲洗根管细胞毒性及杀菌能力的体外研究[D].吉林：吉林大学口腔医学院，2010.

[4]刘宝娟.根管冲洗用臭氧液制备与应用的基础研究[D].陕西：中国人民解放军第四军医大学口腔医学院，2006.

[5]王雪梅，王戈，仇丽鸿，等.不同根管消毒药物对粪肠球菌杀菌效果的体外研究[J].中国医科大学学报，2012，12(41)：1113.

[6]Egusa H，Watamoto T，Matsumoto T，et al.Clinical evaluation of the efficacy of removing microorganisms to disinfect patient-derived dental impressions[J].Int J Prosthodont，2008，21(6)：531.

[7]孙莹莹，于静涛，刘扬，等.不同消毒方法对感染根管内粪肠球菌抗菌性的研究现状[J].中国实用口腔科杂志，2011，12(4)：759.