联用大黄素、黄芩苷对牙周炎大鼠炎症因子影响的研究

牙周炎发病机制目前主要认为是菌斑及其毒性产物引发牙周组织的炎症,同时激活宿主细胞释放多种炎症介质,而牙周炎症牙龈组织局部细胞因子网络失调是牙周炎进展的主要原因[1]。已有文献报告黄芩苷可通过抑制炎症因子及促进牙周膜细胞增殖,保护牙周膜细胞。而清热类中药大黄的主要成分大黄素对牙周常见厌氧菌牙龈卟啉菌和中间普氏菌具有明显的抑制作用并可抑制多种炎症介质[2]。另有研究报告联用淫羊藿苷、黄芩昔和大黄素可在体外明显抑制IL-1β诱导的骨吸收[3]。联合应用黄芩苷、大黄素治疗牙周炎的在体试验罕有文献报告,我们通过建立大鼠牙周炎模型,探讨联合应用黄芩苷、大黄素对牙周炎大鼠牙龈组织炎症介质TNF-α、IL-6的影像。

1材料与方法

1.1主要药物与试剂

大黄素、黄芩苷购自北京生物制品检验所(纯度>98.5%)。TNF-αELISA试剂盒购自晶美生物工程公司,IL-6ELISA试剂盒购自RδD System Ins。组织匀浆TNF-α、IL-6采用ELISA法测定,严格按照试剂盒说明书步骤,TNF-α、IL-6含量的计算单位为pg/mL(ng/L)。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组  清洁级的健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,购自浙江中医药大学实验动物中心,体质量200~250g,随机分为空白对照组、模型组、替硝唑治疗组、黄芩苷治疗组、大黄素治疗组、黄芩苷与大黄素联用组,每组20只,上述各组再随机分为4、8周组,每组10只。分别于术后4、8周处死,取牙龈组织行相应检测。

1.2.2牙周炎动物模型的制作  大鼠经1%戊巴比妥3mg/kg腹腔注射麻醉、固定后,消毒口腔及口周,用口腔正畸结扎钢丝(直径0.2mm)结扎双侧上颌第二磨牙牙颈部1圈,于颊侧拧紧,将结扎头置于牙龈沟内,避免结扎后发生脱落,同时喂食10%糖水浸泡过的饲料和高糖水(100mL水加10g食糖)。

1.2.3给药剂量与方法  大黄素溶液配制:大黄素不溶或微溶于水,易溶于碱性溶液,称取20g大黄素粉,加入1L0.1%的NaOH溶液中,配成20g/L浓度的溶液,4℃下保存各用。黄芩苷溶液配制:黄芩苷10g,配成10g/L的贮存液各用。替硝唑溶液配制:替硝唑片研碎至粉末,精确称取100mg粉末,加人1mL蒸馏水,玻璃棒充分搅拌至溶解,配成10Og/L浓度的溶液。给药途径和剂量:大黄素治疗组以80mg/kg大黄素溶液灌胃,黄芩苷治疗组以40mg/kg黄芩苷溶液灌胃,联用组以40mg/kg大黄素溶液+20mg/炖黄芩苷溶液灌胃,替硝唑治疗组以400mbo/碹替硝唑溶液灌胃,空白对照组和模型组均以等体积生理盐水灌胃。

1.2.4观察指标及测定方法  ①存活率:观察各时间点大鼠的存活情况。②各组大鼠一般情况观察如毛色、反应等。③大鼠口腔组织变化情况,牙龈有无红肿、牙周袋、牙根暴露等。④牙龈组织TNF-α及IL-6含量测定:分批处死大鼠后取牙龈组织,4℃下制成组织匀浆,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学方法

统计结果以平均数±标准差表示,用SPSS10.0软件进行统计分析,检测指标结果先进行AN0VA检验,组间两两比较再用(LSD)方差分析或两两间独立样本t检验,以P<0.O5表示有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

至8周实验完全结束后,各组大鼠无一死亡,存活率100%。正常对照组大鼠进食和活动均正常、毛色光亮、反应敏捷。模型组大鼠出现被毛无光泽、少动倦怠、进食下降等现象,而各治疗组大鼠未见明显萎靡现象。

2.2口腔组织变化情况

空白对照组大鼠口腔组织表现正常,牙龈无红肿,无牙周袋,无牙根暴露等。模型组大鼠第28天出现双侧第二磨牙区牙龈组织红肿,2周后牙龈肿胀,触之出血,第二磨牙出现较明显的松动,牙周袋逐渐形成并加深,牙根暴露现象明显。各治疗组结扎处磨牙较模型组病变明显减轻,其中替硝唑治疗组在结扎后第28天可观察到结扎处牙龈组织轻度炎症现象,大黄素治疗组牙龈红肿较明显、探诊易出血,第56天时炎症进一步加重,部分结扎牙齿己观察到牙龈糜烂、根分叉暴露。联用组大鼠第56天可观察到牙龈肿胀,触之出血,但松动及牙根暴露不明显。各组非结扎处均未观察到明显牙周炎症状。

2.3牙龈组织TNF-α及IL-6含量测定结果

各组牙龈组织TNF-α及IL-6含量检测结果见表1,其中4、8周时间点,模型组较空白组牙龈组织TNF-α及IL-6含量升高(P<0.01)。4周时间点,除联合治疗组、替硝唑治疗组外,各治疗组牙龈组织IL-6含量均较空白组明显升高(P<0.05);8周时间点,各治疗组与空白组比较,TNF-α及IL-6组织含量均明显升高(P<0.01)。除大黄治疗组外,各治疗组牙龈组织TNF-α含量在4周及8周时间点均较模型组明显下降(P<0.05)。在4周及8周时间点,各治疗组牙龈组织IL-6含量均较模型组明显下降(P<0.05)。在4周及8周时间点,黄芩苷治疗组和替硝唑治疗组牙龈组织TNF-α含量无显著性差异,联合治疗组和替硝唑治疗组牙龈组织IL-6含量无显著性差异。联用组在4、8周时间点牙龈组织TNF-α和IL-6含量均较大黄素组降低(P<0.05),而与黄芩苷组比较,在早期(4周时间点)TNF-α含量均降低(P<0.05),但8周时2组无显著性差异。

3讨论

黄芩苷是唇形科植物黄芩的有效成分之一,属葡萄糖醛酸苷类,水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸,具有清热解毒、抗炎、利胆、降压、利尿、抗变态反应等多方面的作用,并可通过降低牙周组织IL-6的含量,增加IL-4的分泌量,从而纠正牙周炎时Thl/Th2细胞因子的失调状况,具有明显的治疗效果[4]。大黄素为中药大黄的主要有效单体,属蒽醌类衍生物(3一羟甲基-1,6,8一三羟基蒽醌),具有抗菌谱广,抗菌活性强的特点,对肺炎双球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌及多种常见的致病性真菌均有较强的抗菌作用[5]。

牙周炎发病过程中,中性粒细胞在炎症刺激下生成和释放的大量TNF-α。研究发现,TNF-α是牙周病发生过程中的一个重要炎症因子,TNF-α的水平上升与牙周组织破坏密切相关,可刺激牙龈成纤维细胞产生胶原酶,导致牙龈组织破坏和骨吸收[6]。同时,TNF-α的表达与牙周炎根尖病损面积的变化呈相同趋势,说明根尖周组织产生炎症性骨吸收的过程中,TNF一α与牙周骨质破坏、破骨细胞骨吸收活性增强有密切关系[7]。在众多炎症因子中,IL-6的表达水平与牙周炎的严重程度也密切相关。有研究表明,1L-6可通过损伤内皮系统,减弱牙周组织的修复能力,破坏牙槽骨,抑制牙周膜细胞的生长,加重牙周炎[8-10]。本研究发现,在4周及8周时间点,模型组牙龈组织IL-6含量较空白组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),而相同时间点各治疗组均较模型组明显下降(P<0.05)。随着时间的延长,组织IL-6含量也有不同程度的升高,表明随着炎症的发展加重,局部牙龈组织中1L-6含量增加,且与TNF-α的增加相关,从而加重组织炎症变化。

根据中医药理论,复方效果往往好于单味药物,大黄、黄芩为清热解毒方剂中常用药对,而大黄素、黄芩苷又是二者的主要有效成分,在某些方面两者的作用是相辅相成的,因此我们推测两者的联用将取得更好的效果。而本研究也证实了联合应用大黄素与黄芩苷,与单用大黄素或黄芩苷相比,进一步降低了牙龈组织TNF-α和IL-6的含量。联用组在4、8周时间点牙龈组织TNF-α和IL-6含量均较大黄素组明显降低,而与黄芩苷组比较,在早期(4周时间点)TNF-α和lL-6含量均显著降低,但8周时2组无显著性差异,结果提示联用后的疗效优于单用大黄素或黄芩苷。

[参考文献]

[1]吴婷,孙钦峰白细胞介素与牙周炎的研究进展[J]口腔医学,2009,29(ll):610-612.

[2]郑素平.大黄素抗炎作用及对急性胰腺炎治疗作用研究进展[J]四川生理科学杂志,2006,28(4):175-177.

[3]王国芳,吴织芬,郭留云淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合作用对体外骨吸收的影响[J]口腔医学,20O9,29(2):69-72.

[4]饶利佳,卢嘉健,吕芳丽,等黄芩甙对牙周炎小鼠血清白细胞介素-6和白细胞介素-4水平的影响[J]中国病理生理杂志,2011,27(3):550-554.