不同剂量rhBMP-2对DO和新骨表达eNOS的影响

　　作者：马岩,王稚英,李新伟　　作者单位：1辽宁医学院附属第二医院口腔内科,辽宁锦州121001 2 浙江医学高等专科学校口腔教研室 浙江杭州310000

　　【摘 要】 目的 探讨不同剂量基因重组人骨形成蛋白(rhBMP-2)对兔下颌骨牵引区新骨生成及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。 方法 日本大耳白兔45只，随机分为3组，每组15只，建立动物模型，通过组织学观察和免疫组化方法检测新骨形成及其表达的eNOS。 结果 同一时间点新骨随rhBMP-2的增多而变成熟。eNOS的峰值rhBMP-2组较空白组前提;在同一时间点eNOS随rhBMP-2的增多而表达增强，在28d时各组表达的eNOS无明显差异。 结论 rhBMP-2在成骨早期以剂量依赖方式促进兔下颌牵引区eNOS的表达和新骨形成。

　　【关键词】 牵引成骨;基因重组人骨形成蛋白2;内皮型一氧化氮合酶

　　Effects of rhBMP┐2on mandibular distraction osteogenesis and the expression of eNOS in the new bone MA Yan，WANG Zhi-ying，LI Xin-wei.(Department of Oral Surgery，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Col-lege，Liaoning121001，China)

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of different concertrations of rhBMP-2on mandibular distraction osteogenesis and the expression of eNOS in the different consolidation period of distraction osteogenesis.Methods The distraction osteogenesis model was set up.And then the specimens were examined histologically and immunohis┐tochemically.Results Both mandibles of each animal were lengthened successfully.In the same period，the new bone matured as the concentration of rhBMP-2increased.The peak of eNOS advanced as the concentration increased.In the same period，the expression of eNOS increased with the concentration of rhBMP-2，and there were not many differ-ences between the three groups28days after distraction.Conclusion It suggests that rhBMP-2can stimulate the for-mation of the new bone and the expression of eNOS on a dose-depended manner in distraction osteogenesis.

　　【Key words】 Mandibular osteo-distraction;Recombinant human morphogenetic protein;eNOS

　　目前骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthases，NOS)已被证明与骨形成有密切关系。BMP在胚胎发育、骨折愈合及骨缺损修复过程中发挥重要调节作用，其中又以BMP-2与骨愈合和骨修复关系较密切。NOS本身和其产生的NO可促进骨折愈合或通过释放一些生长因子促进骨折愈合。本实验观察不同剂量rhBMP-2对牵引成骨(distraction osteogenesis，DO)过程中骨形成及其表达eNOS的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成年日本大耳白兔45只，体重2.0～2.5g(锦州医学院实验动物中心提供);含rhBMP-2的胶原载体及空白胶原载体(北京军事医学科学院);SABC免疫组化试剂盒(武汉博士得试剂公司);外置式牵引器(西安中邦公司)，LEITZ1512切片机(德国);OLYMPUS万能显微镜及照相系统(日本);细胞图像分析系统(北京CIAS-1000)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组 将45只日本大耳白兔随机分为3组，每组15只(每个时相点均3只)，空白对照组(Control group)骨膜下植入不含rhBMP-2的胶原海绵载体，第1实验组(Group1)骨膜下植入含rhBMP-21.5mg的胶原海绵载体，第2实验组(Group2)骨膜下植入含rhBMP-23mg的胶原海绵载体。

　　1.2.2 实验动物模型的建立及标本处理 在全麻下于兔双侧下颌磨牙前将下颌骨垂直切开，造成完全性骨折，保留舌侧骨膜，安置牵引器，延迟期5d，随后以0.4mm/次、2次/d的速率和频率牵引5d。分别于固定期的第1、3、7、14、28天处死动物，取材后将标本用4%多聚甲醛固定过夜(4℃)，乙二胺四乙酸钠(ED-TA)脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，近远中向4μm连续切片，多聚赖氨酸包被的玻片捞片，60℃烤片30min。

　　1.2.3 组织学检测 取上述标本，做HE染色，光镜观察。

　　1.2.4 免疫组织化学检测 取上述标本，二甲苯脱蜡梯度水化至水，枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)热修复12min，冷却至50℃，PBS漂洗5min3次，3%过氧经氢室温孵育20min，PBS漂洗5min3次，血清封闭，室温20min，不洗，滴加一抗(1∶100稀释)，37℃孵育1.5h，PBS漂洗5min3次，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗5min3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素37℃30min，PBS漂洗5min3次，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并照相。以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 统计学方法 数据处理应用EXCEL软件和SPSS11.5版统计分析软件，采用方差分析对结果进行处理分析。

　　2 结果

　　2.1 组织学观察 固定期第1天牵引间隙中为无序排列的梭形未分化间充质细胞，Group1和Group2细胞出现沿牵引方向排列的趋势，Group2骨膜下骨 祖细胞向成骨细胞分化，间充质细胞增殖并向纤维细胞分化;第3天沿牵引方向排列的纤维样条索、成骨细胞和肥胖的间充质细胞，结缔组织间新生血管增多，Group1和Group2牵引方向排列现象明显。第7天Group2断端边缘和骨膜下可见针状骨小梁，排列紊乱，周边可见成骨细胞增生活跃，血管丰富，部分区域已有骨髓腔形成;Group1出现少量小梁。第14天Group2膜内成骨活跃，骨小梁变粗、变密集，并沿牵引力方向排列成网状;Group1新生骨小梁增多;Con-trolGroup出现少量骨小梁。第28天Group2出现哈拂管系统，成熟骨几乎占据了整个间隙，成骨细胞和破骨细胞增多，提示处于骨改建期;Group1骨髓腔基本形成;Control Group牵引间隙为较成熟骨组织充满，见表1。表1 各实验组生成新骨的平均灰度值(略

　　2.2 免疫组织化学观察 新生骨表达eNOS的平均灰度值，见表2。其表达具有时间变化特点，同一时间点Group1和Contreol Group差异有显著性(P<0.05)，Group2与Control Group差异有显著性(P<0.01)。同一时间点随rhBMP-2增多，eNOS表达增强。空白对照组未见阳性信号。 表2 各实验组表达eNOS的平均灰度值(略)

　　3 讨论

　　Li等[1] 认为eNOS的表达可被许多生理、生化和激素促进，如剪应力、生长因子、激素和其他的化合物。rhBMP-2以剂量依赖方式促进eNOS表达，而这种促进使用在28d时减弱，这可能与此时骨组织较成熟，主要细胞成分骨细胞功能活动减弱有关。

　　Nomura等[2] 证实eNOS在骨形成早期表达，由NOS产生的NO在早期参与对机械压力的反应，NOS被认为是机械反应性的。由eNOS产生的NO在血管体内平衡中发挥重要作用，它可引起血管扩增，而提高NO含量可能对损伤修复有治疗价值[3] 。Namba等[4] 证实肌注eNOS可在大鼠缺血后肢中诱导血管再生。BMP在骨形成早期促进骨形成，可促进成骨细胞样细胞分化、促进骨诱导力、骨基质形成和矿化、血管形成及体内成骨前体细胞分化[5] 。BMP不能促进成熟成骨细胞的分化和增殖，并且成熟的成纤维细胞在经过BMP-2处理后不能诱导骨源性参量的表达 [6，7] 。

　　本实验中rhBMP-2以剂量依赖方式促进成新骨形成，而这种作用在成骨早期明显，28天时其作用明显减弱，表明rhBMP-2对骨形成的促进作用可能在某种程度上与其促进eNOS的表达有关，因eNOS表达的升高和其产生的NO可以促进血管的生成并增加血流量，从而为骨形成提供更充足的营养供给，促进骨形成;而rhBMP-2对eNOS的促进作用在28天时下降，所以rhBMP-2只在骨形成早期发挥其促进成骨功能，但其确切机制尚需进一步研究。

　　在DO过程中应用rhBMP-2和eNOS的作用是肯定的，如何应用rhBMP-2和eNOS促进骨折更快更好的愈合就成为我们进一步研究的目标。

　　【 参 考 文 献 】

　　[1] Li H，Wallerath T，Forstermann U.Physiological mechanisms regulating the expression of endothelial-type NO synthase[J].Nitric Oxide，2002，7(2):132-147.

　　[2] Nomura S，Takano-Yamamoto T.Molecular events caused by mechanical stress in bone[J].Matrix Biol，2000，19(2):91-96.[3] Kvasnicka T.NO(nitric oxide)and its significance in regulation of vascular homeostasis[J].Vnitr Lek，2003，49(4):291-296.