三七总皂苷对慢性肾缺血肾间质纤维化的防治作用

　　作者：谢纪青,金建生,付次双　　作者单位：福建医科大学 附属厦门第一医院肾内科，厦门

　　【摘要】目的观察三七总皂苷(PNS)对大鼠慢性肾缺血的保护作用及其机制。 方法 将大鼠随机分为假手术组，模型组及PNS治疗组。建立肾动脉狭窄肾缺血大鼠模型，分别于造模后第7，28，45，60天处死大鼠。观察肾间质病理形态学变化，应用免疫组织化学法检测肾小管间质αSMA在不同时间点的表达，放射免疫分析法检测血清IL2的含量、ELISA检测血清血小板源性生长因子(PDGF)的含量。 结果 模型组肾间质纤维化的程度，肾小管上皮细胞及间质αSMA的表达和血清PDGF的含量在各时间点明显高于假手术组(P<0.01)，PNS治疗组上述各项指标在不同时间点明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。模型组血清IL2含量在7 d时显著升高(P<0.01)，之后迅速下降到假手术组水平，45 d时显著低于假手术组(P<0.05)。PNS治疗组血清IL2含量在7 d时低于模型组(P<0.05)，其他时间点差别无统计学意义。 结论 PNS可能通过抑制肾小管间质细胞表型转化，降低细胞因子PDGF的水平和早期IL2的水平减轻和改善慢性肾缺血肾间质纤维化。

　　【关键词】 三七皂甙,慢性病,肾; 缺血; 间质细胞; 白细胞介素2; 血小板源性生长因子; 肌动蛋白类

　　近年来认为“慢性肾缺血”是肾纤维化的第一个信号，缺血作为一种独立因素导致肾小管间质损伤乃至肾间质纤维化为越来越多的学者重视[12]。在肾间质纤维化的过程中，细胞因子如血小板源性生长因子(plateletderived growth factor,PDGF)和白细胞介素2(intreleukin，IL2)表达增加，肾小管上皮细胞转分化、α平滑肌肌动蛋白的表达均起了重要的作用[34]。中药三七[主要成分三七总皂苷(panaxnotoginseng saponins，PNS)]具有多种生物学效应。中药及其提取物对肾小管间质纤维化的作用近年来研究较多，效果比较肯定的是PNS。本实验通过制备慢性肾缺血大鼠模型，应用PNS进行早期干预，探讨细胞因子(PDGF、IL2)在慢性肾缺血中的作用及PNS对大鼠慢性肾缺血产生的保护作用及其可能的机制。

　　1 材料及方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠SPF级65只，体质量180～200 g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)20070005]。大鼠编号并按数字随机分组，实验分假手术组(n=21)，模型组(n=22)、PNS治疗组(n=22)。分组后大鼠分笼饲养，自由饮水、进食，适应环境3 d。

　　1.1.2 主要药物与试剂 注射用血栓通(冻干)，主要成分为PNS(纯度>80%)，购自重庆药友制药有限公司(批准文号：国药准字Z20025652)，每瓶150 mg，使用前按10 mg∶1 mL蒸馏水配制;PDGFBB夹心法酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(产品编号EK0485);兔抗大鼠αSMA抗体(产品编号RB9010)、即用型快速免疫组织化学MaxVisionTM试剂盒(产品编号KIT5004，福州迈新公司);IL2放射免疫试剂盒(产品编号C11PDA，北京北方生物技术研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型建立及标本收集 模型组和PNS治疗组按照文献[5]的方法建立双侧肾动脉狭窄模型。假手术组仅分离双侧肾动脉而不结扎。造模后PNS治疗组每天腹腔注射1%的血栓通50 mg·kg1，假手术组和模型组同时给予等量生理盐水腹腔注射。造模后第7，14，28，45天每组分别选取5只大鼠处死，取血，离心分离血清，血清储存于-20℃冰箱中待测;处死大鼠后迅速取其左肾脏，4%甲醛固定，苏木素伊红染色(HE染色)、Masson染色观察病理变化，免疫组织化学观察肾小管间质αSMA表达。

　　1.2.2 肾脏常规病理检查 行HE染色、Masson染色，在光镜下观察肾组织形态学改变，间质纤维化半定量分析方法如下：Masson染色切片，每张切片观察10个不含肾小球和大血管的皮质视野，呈现为绿色的纤维区域视为阳性目标，以阳性面积占统计场总面积的百分比作为肾小管间质的纤维化指数。标准为：0分，无病变;1分：染色面积≤25%;2分：25%<染色面积≤50%;3分：染色面积≥50%[6]。

　　1.2.3 免疫组织化学染色检测αSMA 采用MaxVisionTM即用型快速免疫组织化学一步法检测αSMA的表达。一抗αSMA鼠单克隆抗体(1∶25稀释度)，严格按照试即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒说明书操作，光镜下观察阳性信号。在400倍镜下随机选择20个不重叠视野观察肾小管间质(避开肾小球和大血管)细胞质出现棕褐色颗粒样阳性染色面积与同视野肾小管间质面积(除去肾小管管腔)的百分比进行半定量分析。计分方法：视野的评分主要反映小管间质阳性染色的范围而非强度：0分：无染色;1分：染色面积<5%;2分：5%≤染色面积<25%;3分：25%≤染色面积<50%;4分：50%≤染分面积<75%;5分：染分面积≥75%。如上所述取10个视野，结合每个视野评分，取平均分。排除肾小球和血管。

　　1.2.4 血指标测定 采用放射免疫分析法测定血清IL2含量，按说明书操作;血清PDGFBB的水平检测也严格按照PDGFBB夹心法ELISA试剂盒说明书操作。

　　1.3 统计学处理 数据采用SPSS 14.0统计软件包处理。ELISA、放射免疫和免疫组织化学检测结果均以x±s表示，多组间均数的比较采用采用单因素的方差分析，HE、MSASSON染色和免疫组织化学结果进行半定量分析。对IL2,PDGF，αSMA的半定量评分采用Pearson相关分析，以α=0.05为检验水准。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠肾组织的病理变化 假手术组大鼠肾小管间质未见异常。模型组大鼠术后7 d肾小管上皮细胞肿胀、坏死及脱落，以皮髓质交界区为著，管腔内可见脱落上皮细胞，肾间质水肿，间质内有散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润，肾小球结构正常。术后14 d肾小管上皮细胞肿胀基本消失，大量炎症细胞侵润，皮质及外髓部位逐渐出现萎缩及扩张的小管，部分小管刷状缘丢失。术后28 d肾小管和间质的结构破坏更加严重，上皮细胞大量坏死,弥漫性炎症细胞浸润，皮髓质均出现明显的纤维化区域，主要位于损伤的小管及血管周围;术后45 d间质纤维化程度加重，出现弥漫的细胞增殖。PNS治疗后，在上述不同时间点大鼠肾小管间质损害和炎细胞浸润显著改善(以28 d为例，图1)，间质纤维化的程度在各时间点减轻(P<0.05或P<0.01，表1，以28 d为例，图2)。

　　A：假手术组肾小管结构正常，间质无纤维化; B：模型组肾小管上皮细胞大量坏死，弥漫性炎症细胞浸润，皮髓质均出现明显的纤维化区域; C：与模型组比较，三七总皂苷治疗组肾小管和肾间质改变明显减轻.

　　A：假手术组肾小管结构正常，间质无纤维化; B：模型组肾小管上皮细胞大量坏死，弥漫性炎症细胞浸润，皮髓质均出现明显的纤维化区域; C：与模型组比较，三七总皂苷治疗组肾小管和肾间质改变明显减轻.

　　2.2 各组大鼠肾组织αSMA的表达 在假手术组肾小管间质，αSMA仅见于血管、肾小球、肾小管以及肾间质均未见αSMA阳性表达，模型组和治疗组于术后7 d有少量肾间质细胞表达αSMA，术后28 d可见大量的阳性细胞出现在肾间质中。随着缺血时间的延长肾小管间质细胞αSMA表达的强度递增，部分小管上皮细胞内也出现阳性棕黄色染色颗粒，阳性染色主要呈颗粒样分布于细胞浆中。与模型组比较,治疗组αSMA的表达在28 d、45 d明显减小(P<0.05或P<0.01，表1，图3～4)。

　　A：假手术组，细胞质无阳性棕褐色染色颗粒; B：模型组，细胞质出现棕褐色颗粒样阳性泾色面积较多;C：三七总皂苷治疗组，细胞质出现棕褐色颗粒样阳性染色面积较模型组减少.

　　A：假手术组，细胞质无阳性棕褐色染色颗粒; B：模型组，细胞质出现棕褐色颗粒样阳性泾色面积较大;C：三七总皂苷治疗组，细胞质出现棕褐色颗粒样阳性染色面积较模型组减少.

　　2.3 各组大鼠血清PDGFBB和IL2的含量 与假手术组相比，模型组和治疗组血清PDGFBB含量升高(P<0.01)。模型组和治疗组血清PDGFBB含量有增高趋势，在28 d时最高，两组的PDGFBB含量在7 d时比较无显著差异。治疗组血清PDGFBB含量在14，28，45 d的水平均低于模型组(P<0.05或P<0.01，表1)。假手术组血清IL2含量在不同时期基本处于稳定水平，模型组和治疗组血清IL2含量在7 d时显著高于假手术组(P<0.01)，之后迅速下降到假手术组水平，45 d时显著低于假手术组(P<0.05)，治疗组血清IL2含量在7 d时低于模型组(P<0.05，表1)。

　　2.4 相关分析 肾间质纤维化与αSMA 的表达，血清PDGFBB的水平呈正相关关系，r分别为0.952和0.704(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　既往大量的研究表明，PNS对肾脏具有保护作用，可有效阻止和延缓肾间质纤维化。其药理作用包括抑制肾小管上皮细胞的增殖及胶原分泌，拮抗肾小管上皮细胞表型转化，拮抗细胞因子介导的肾间质纤维化的作用等。本实验发现模型组大鼠肾脏病理改变显著加重，肾小管间质纤维化评分明显增高，PNS治疗组在不同时间点大鼠肾组织HE染色，Masson染色的病理变化明显减轻，表明PNS对慢性肾缺血肾间质纤维化具有抑制作用。

　　慢性缺血性肾病的病理生理变化并未完全清楚，目前认为肾小管间质细胞表型转化是促进缺血后肾间质纤维化发展的重要因素。杨晓萍等研究表明肾小管间质中αSMA的表达随着肾间质纤维化的进展表达量逐渐增多，与肾间质纤维化的程度呈正相关[7]。本研究中αSMA阳性表达于术后进行性增高，主要集中在肾小管受损和间质纤维化较明显区域，且与肾小管间质纤维化程度呈正相关关系，与相关报道相一致[8]，说明单纯慢性肾缺血所致肾小管上皮细胞表型改变可诱导肾间质细胞向MyoFB表1 各时间点肾间质纤维化、αSMA半定量评分及血清PDGF、IL2的结果转分化，并在纤维化的发展过程中起到重要作用。同时发现PNS治疗组αSMA阳性表达的细胞明显减少，说明PNS能明显抑制肾脏小管细胞向MyoFb的转分化及增殖，从而降低细胞外基质合成，使肾间质纤维化程度减轻。细胞因子在肾间质纤维化中也起到重要作用，PDGFBB具有强效促进细胞分裂增殖的作用，是有关各种原因所致肾间质纤维化形成机制研究的重点，且PDGFBB在病理状态下表达增多，刺激间质成纤维细胞的增值和细胞外基质的增多，参与肌成纤维细胞聚集、增生、表型转化，促进肾小管间质纤维化[9]。Suzuki等在肾小管栓塞大鼠模型中的观察结果发现，Vimentin+的肾小管通过表达PDGF可以促进其周围的成纤维细胞集聚，并向MyoFB转分化[10]。本试验结果显示，模型组大鼠血清PDGF有上升趋势，且与肾间质纤维化呈正相关，提示PDGFBB参与慢性缺血致肾间质纤维化，在同一时间点治疗组血清PDGFBB含量和病理损害较模型组下降，说明同一时间点PNS能降低血清PDGFBB含量，起到抑制肾间质纤维化的作用。

　　有研究表明，IL2具有促进T淋巴细胞的体内增殖，增强T淋巴细胞和NK细胞的杀伤活性，诱导T淋巴细胞分泌多种细胞因子的作用[11]。本研究显示，与假手术组相比，模型组和治疗组血清IL2含量在7 d时显著升高(P<0.01);同时有研究表明，IL2可诱导巨噬细胞表达IL1、TNFα、TGFβ和PDGF，从而作用于成纤维细胞，说明在肾间质纤维化的早期高水平的IL2有促进炎症反应的作用;模型组和治疗组血清IL2含量在45 d时显著低于假手术组(P<0.05)，从IL2不仅可以促进本身自分泌，还可诱导T细胞增殖产生IFNγ等细胞因子，起着相互协同抗肝纤维化作用中推测，在晚期IL2含量的降低对肾间质纤维化有促进作用[12]。研究证实IL2有抑制血吸虫病小鼠肝脏胶原纤维的沉积，发挥抗肝纤维化的作用。治疗组血清IL2含量在7 d(P<0.05)时低于模型组，其余时间两组水平相当，说明PNS在早期可抑制细胞免疫，抑制IL2的分泌，但以后不能通过改变IL2的含量影响肾间质纤维化。

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