冠心病患者血清CETP水平及其D442G突变的相关性研究

　　作者：王伟,罗蓉,李卓成,陈剑雄　　作者单位：深圳市第二人民医院检验科，广东 深圳 518035

　　【摘要】目的：研究中国汉族人群血清胆固醇酯转运蛋白(CETP)水平，以及其基因D442G 突变与冠心病的相关性，同时分析其与血脂水平的关系。方法：采用聚合酶链反应 – 限制性片段长度多态性(PCR – RFLP)的分析方法，检测102 例冠心病患者和347 例对照组的CETP 基因D442G 突变的基因型，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测冠心病患者和对照组血清CETP 水平。结果：CETP 基因D442G 突变与冠心病的危险性无显著相关性;CETP 基因D442G 突变的DG 杂合子具有较高的高密度脂蛋白胆固醇水平。结论：CETP 基因D442G 突变对人群血脂水平有一定影响，未见D442G 突变与冠心病有相关性，该突变可能不是冠心病的主要危险因素。

　　【关键词】 冠状动脉疾病,胆固醇酯转运蛋白,胆固醇酯类;基因突变

　　〔Abstract〕Objective To study the relationship between serum levels of CETP or the D442G mutation and the D442G mutation and coronary heart disease(CHD)among Chinese Han. Methods The genotypes of CETP were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) methods in 102 patients with CHD and 347 healthy controls, and the serum level of CETP was determined by enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA). Results The results showed that neither the frequencies of genotypes nor those of alleles of CETP gene D442G mutation were statistically different between patients and controls( P > 0.05). We also found that there were no relationship between CHD and CETP gene D442G mutation. The DG genotype displayed higher HDL-C levels than DD genotype( P < 0.05). Conclusion The CETP gene D442G mutation might be effect the levels of the lipids and lipoproteins, but were not major genetic factors of CHD in Han nationality from southern China.

　　〔Key Words〕Coronary artery disease;Cholesteryl ester transfer protein;Cholesterol esters;Gene mutation

　　大量人群研究表明，血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL – C)水平与冠心病危险性具有负相关。胆固醇酯转运蛋白(CETP)是胆固醇逆向转运(RCT)的携带蛋白，是HDL 代谢的关键蛋白。研究认为CETP 基因变异与高密度脂蛋白(HDL)水平相关，并由此影响动脉粥样硬化(AS) 的发生与发展[1-2] ， 从而影响对心血管疾病的易感性。D442G突变是CETP 基因第15 外显子第442 位密码子A– G 错义突变，导致第442 位天冬氨酸突变为甘氨酸。有研究认为[2-4]，D442G 突变通过降低HDL 到VLDL 的胆固醇酯转运活性增加HDL – C 水平，从而可能影响动脉粥样硬化及相关疾病的发生发展。但是目前关于CETP 基因变异及CETP 浓度与活性变化对血清脂蛋白代谢的影响，CETP 基因变异与冠心病的关系研究尚不多。为了探讨CETP 基因D442G 突变与冠心病发生的关系，我们采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR – RFLP)技术，研究了广东地区汉族人群CETP 基因D442G 突变分布特点、与冠心病的关联性及其对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象受试者均为本院2007 年10 月 – 2008 年12 月住院患者。冠心病组：102 例，男62 例，女40 例，年龄42~78(62.9±9.6)岁，冠状动脉造影阳性(至少1 支主要冠状动脉直径狭窄≥ 50%)。对照组：347 例，男195 例，女152 例，年龄35~72(59.5±8.4)岁，经生化、心电图及冠状动脉造影排除心脏疾患，且肝肾功能正常。以上所有研究对象均为广东汉族自然人群，相互无血缘关系，有糖尿病、肾病综合征、肾功能不全、肝脏疾病、甲状腺和肾上腺疾病等影响脂质代谢的疾病除外。两组间年龄、BMI、收缩压和舒张压差异无统计学意义(P > 0.05)。冠心病组男性患者多于女性，吸烟、高血压的患者明显高于对照组(P < 0.05)。冠心病和对照组比较，TC水平升高，HDL – C水平降低，具有显著性意义(P < 0.05)，其他指标不具有统计学意义(P > 0.05)，见表1。

　　1.2 主要仪器与试剂BECKMAN DXC800 自动生化分析仪系美国贝克曼公司产品;PCR 仪系美国Bio – Rad 公司产品;CliniBio128 型酶标仪系奥地利ASYS 公司产品;UVI 自动凝胶成像分析系统系美国UVltec 公司产品。血清总胆固醇(TC)和TG 测定采用上海申能公司试剂;血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL – C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL – C)、载脂蛋白(apo)A I、B 和CETP 浓度测定采用日本第一化学药品株式会社试剂。TaqDNA 聚合酶、dNTPs、引物、Msp I 限制性内切酶、Ladder Marker 均为华美生物工程公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本采集 空腹12 h 后抽静脉血，一管用EDTA – K3 抗凝，分离血浆及白细胞层，其中自细胞层供提取DNA;另一管不抗凝，分离血清后，– 80℃保存用于测定生化指标。

　　1.3.2 血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平测定 血清TC、TG 测定采用酶法;HDL – C、LDL – C 采用均相测定法;apoA I、apoB 均采用免疫透射比浊法(TIA)。以上测定均在BECKMAN DXC800 自动生化分析仪上进行，每次测定均选用高、中、低3 种质控样品进行质控。

　　1.3.3 血清CETP 浓度测定 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)实验测定CETP 水平，试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供，每次测定均严格按照操作说明书操作。

　　1.3.4 模板DNA 的提取 采用改良的NaI 法提取外周血白细胞基因组DNA。

　　1.3.5 PCR 扩增和酶切分析 应用软件Primer5.0 设计引物， CETP 基因D442G 突变的引物序列为F ：5， – TCA TGA ACA GCA AAG GCG TGA GCCTCT CCG – 3，和R ：5， – AGC CAA GCT GGT AGAGGC CCC TCTGTC TGT – 3，。反应体系同普通的PCR扩增。循环条件为95℃预变性10 min，95℃ 30 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，循环35 次后，72℃延伸10min。将PCR 产物MspI 限制性内切酶酶切。反应终止后分别经2%琼脂糖及8%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。同时用DNA 测序鉴定各基因型。

　　1.4 统计学方法基因频率采用基因计数法计算。研究对象与Hardy – Weinberg 平衡的符合程度 检验。组间基因型与等位基因频率比较用 检验。不同基因型间血脂比较用单因素方差分析(ANOVA)和q 检验。计量资料采用 表示，两组间均数比较采用非配对t 检验。应用多因素logistic 回归分析不同基因型及其他危险因素与冠心病的关联， 结果以比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(95% CI)来表示。所有P 值为双侧检验，P < 0.05 有统计学意义。以上所有统计分析均在SPSS 10.0 软件中进行。

　　2 结 果

　　2.1 CETP 基因D442G 突变基因型的判定根据限制性内切酶MspI 的酶切情况，表现为

　　2.2 DNA 序列分析经过酶切分型后，取PCR 产物经纯化后用四色荧光标记、dNTPs 测序反应试剂盒(BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready)进行测序反应，再次纯化后用ABIPRISMTM310Genetic Analyzer 进行自动测序和序列分析。CETP 基因D442G 突变是位于CETP 基因第15 外显子1506 位的A – G 错义突变，上游引物3 端设计时故意错配以形成MspI 酶切位点(CCGG)，若为突变型(A – G)则有MspI酶切位点。以上均经测序证实了酶切分析的位点准确性。

　　2.3 CETP 基因D442G 突变基因型在两组人群中的分布见表2。在两组人群中均未发现D442G 突变纯合子GG基因型，冠心病CETP 基因D442G 突变频率为4%，而对照组突变频率为6%。结果显示两组的突变频率无统计学意义(P > 0.05)，研究对象各基因型频率符合Hardy – Weinberg 平衡具有群体代表性。DD 基因型，DG 基因型，GG 基因型。PCR 产物为180bp，DD 野生型因无酶切位点仍为180bp，DG 杂合子为180bp 和150bp 两个片断，GG 突变纯合子有MspI 切点，150bp 的1 条带。见图1。M 1 2 3 4图1 CETP 基因D442G 突变的酶切图谱1，2 ：DG 杂合子(180bp，150bp)3 ：DD 野生型(180bp)4 ：PCR 扩增产物(180bp)

　　2.4 CETP 基因D442G 突变不同基因型间血脂和CETP 浓度比较CETP 基因D442G 突变对血脂及载脂蛋白的影响：CETP 基因D442G 突变对HDL – C 水平的影响参见表3，其他血脂及载脂蛋白指标无显著性差异。在对照组或CHD 的同一组中， DG 基因型的(P < 0.05)。DG 基因型的血清CETP 水平与DD 野生型纯合子比较无显著性差异(P > 0.05)。

　　2.5 CETP 基因D442G 突变与冠心病的关系CETP 基因D442G 突变对冠心病的影响：多因素logistic 回归分析经混杂因素调整前后，均发现CETP 基因D442G 突变与冠心病无显著性相关。(OR=0.36，95% CI ：0.55~1.64 ;OR=0.87,95% CI ：0.75~1.82)。

　　3 讨 论

　　胆固醇酯转运蛋白基因位于人类16 号染色体,与卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(lecithin – cholesterolacyltransferase， LCAT)基因邻近，CETP 基因长度为25 kb，包含16 个外显子和15 个内含子[3]。CETP 与AS 的关系比较复杂[1-6]，是通过影响脂质代谢的诸多环节而起的综合作用，具有致AS 或抗AS 两重功能，这依赖于个体本身差异及其自身的代谢状态。CETP 基因缺陷中最主要类型是基因突变，且以基因点突变最为常见，由此产生错义突变和无义突变，也有如基因插入、缺失导致的移码突变。到目前为止，CETP 基因已经发现20 多种突变，如l4 内含子5’剪接供体位点突变G – A(I14A)、15 外显子错义突变442Asp → Gly(D442G) [2-5]、第10 外显子密码子309 的无义突变(Q309X)，第10 内含子剪接供体点突变(GT → GG)，第6显子18 密码子点突变(G181X)，第15 外显子的I405V 突变等等。CETP 基因D442G 突变是第15 外显子错义突变442Asp → Gly(D442G)， 大量资料[2,4,5] 证实日本是目前CETP 基因缺陷最为频发的国家，G442G 突变是日本CETP 基因最常见的突变，约占日本人口4.5%~7%，高 – 脂蛋白血症(HALP：HDL – C ≥ 2.58mmol/L)的18%。本研究发现，中国汉族人群CETP 基因基因型和等位基因频率分布与日本、韩国等亚洲人群分布相近[7-9]。在两组人群中，CETP 基因D442G 突变未检出GG 突变纯合子，中国汉族健康人群D442G 突变频率为6%(21/347)，突变频率与日本人相近(日本人D442G 频率为4~6 %)[2]， 说明该突变在中国人群中亦较为常见。然而该突变较常见于日本人群，其它种族少见报道可能与其突变频率较低有关，该突变发生率在不同人群不同地区是否有差异还需要大量人群调查证实。在本研究中冠心病与对照组比较， D442G 突变基因型之间未见显著性差异(P > 0.05)。本研究发现，CETP 基因D442G 突变对血脂水平特别是HDL – C 水平有一定的影响。在对照组或CHD 的同一组中， DG 基因型的HDL – C 水平明显高于DD 野生型纯合子( P < 0.05)，DG基因型具有比DD 基因型更高的HDL – C 水平(P < 0.05)。DG 基因型的血清CETP 水平与DD野生型纯合子比较无显著性差异( P > 0.05)。本研究认为，CETP 主要通过胆固醇逆转运途径调节血浆HDL – C 的水平，CETP 可以调节脂蛋白颗粒大小、脂质组成和功能，从而与AS 的发生、发展密切相关，这是CETP 基因变异与冠心病可能相关的内在机制。有报道[8]，CETP 基因可能是冠心病的遗传易感基因，TaqlB 多态性B1 等位基因与低HDL – C 水平相关，具有较高的CHD 危险性，是CHD 的危险因子;B2 等位基因具有较高的HDL – C 水平， 患CHD 风险性减少， 可认为B2 等位基因是冠心病的保护因子。D442G 突变DG基因型具有较高的HDL – C 水平，可能与B2 等位基因一起发挥协同作用，共同使CHD 危险性降低。本实验还显示了冠心病的HDL – C 明显低于对照组，而突变频率无明显差异，表明该突变在正常HDL – C 个体和低HDL – C 个体中发生率无明显差异，而在日本人群高HDL – C 个体中发生率较高，达18%，提示CETP 基因缺陷是导致高HDL – C 的重要因素[5]。国外较早的关于CETP基因缺陷文献多认为CETT 基因缺陷患者冠心病(CHD)发病率降低，而zhong[9] 报的3469 名日本男子，CETP 基因缺陷组HDL – C 显著高于非基因缺陷组，但CHD 发病率明显高于对照组。CETP 基因缺陷与AS 的复杂关系，还需进一步的流行病调查。本实验未见D442G 突变与CHD 相关。本研究虽然控制混杂因素的干扰来排除相关分析中可能存在的影响，但鉴于病例 – 对照研究可因候选基因与疾病基因座位间存在着连锁不平衡而产生关联。所以，CETP 基因变异和冠心病的相关性研究今后还需大样本、多区域、多民族的广泛深入研究加以验证。

　　【参考文献】

　　〔1〕Yamashita S,Hirano K,Sakai N,et al.Molecular biology and pathophysiological aspects of plasma cholesteryl ester transfer protein Biochim Biophys Acta,2000,1529: 257-275

　　〔2〕 Inasu A,Jiang XC,Haraki T,et a1.Genetic cholesteryl ester transfer protein deficiency caused by two prevalence mutations as a major determinants of increased levels of high density lipoprotein cholestero1 J Clin Invest,1994,94:1872-1882

　　〔3〕 Agellon LB,Quinet EM, Gillette TG,et al.Organization of the human cholesteryl ester transfer protein gene Biochemistry,1990,13:1372-1376

　　〔4〕 Kuivenhoven JA,Jukema,Zwinderman AH,et a1. The role of a common variant of the cholesteryl ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis:the Regression Growth Evaluation Statin Study Group N En J Med,1998,338:86-93

　　〔5〕 Sakai N,Yamashita S,Hirano K,et al.Frequency of exon 15 missense mutation(442D:G) in cholesteryl ester transfer protein gene in hyperalphalipoproteinemic Japanese subjects Atherosclerosis,1995,114:139-145

　　〔6〕 Corbex M,Poirier,Fumeron F,et a1.Extensive association analysis between the CETP gene and coronary heart disease phenotypes reveals several putative functional polymorphisms and gene-environmental interaction Genet Epidemiol,2000,19:64-80

　　〔7〕 庄一义, 汪俊军, 强宏娟, 等. 心脑血管疾病患者胆 固醇酯转运蛋白及某些基因缺陷 中华检验医学杂 志,2001,24:98-101

　　〔8〕王伟, 周新, 刘芳, 等. 胆固醇酯转运蛋白基因TaqIB 多态性、D442G 突变与冠心病的相关性研究 中华心血管病杂志,2004,32:981-985

　　〔9〕Zhong S,Sharp DS,Grove JS,et al.Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels J Clin Invest,1996,97:2917-2923