不对称牵引对成年大鼠髁突软骨Ⅱ型胶原的影响

　　作者：吴拓江 许跃 李煌 瞿灵丽 陈扬熙 作者单位：(南京医科大学 口腔医学研究所，江苏 南京 210029;中山医科大学附属光华口腔医院 正畸科, 广东 广州 510055;南京大学附属口腔医院 牙体牙髓科，江苏 南京 210008;四川大学华西口腔医院 正畸科，四川 成都 610041)

　　【摘要】 目的 通过观察不对称牵引引起的成年SD大鼠髁突软骨中Ⅱ型胶原的变化，了解关节外机械应力对髁突软骨细胞合成Ⅱ型胶原活性的影响。方法 选用10周龄雄性SD大鼠220只(随机分为轻力组104只、重力组104只、对照组12只)，实验组动物使用关节外固定加力装置，分别施加0.39 N和1.18 N(轻力组和重力组)，加力第28天拆除加力装置。在加力后3、7、14、28 d以及停止牵引后3、7、14、28 d分别取得标本，进行免疫组化染色。结果 Ⅱ型胶原阳性信号主要在软骨细胞胞浆表达，在成熟带和肥大带细胞中表达明显。在实验的不同阶段，不同部位的发生表达强度不同。在牵引力加载以后，重力组Ⅱ型胶原表达的变化的幅度不如轻力组明显，但2组相对应的加力侧和非加力侧发生的变化趋势相近——加力侧在加力早期出现表达下调，在去除牵引力后出现表达量的增加，随即又下降到在加力阶段最低的水平，然后逐渐升高;非加力侧在加力后表达上调，2组在第14天达到高峰。去除牵引力后，发生下调，然后都再次升高。结论 成年个体的髁突软骨在受到外力后仍然出现了Ⅱ型胶原合成的变化。Ⅱ型胶原的表达在蛋白质合成活跃的成熟带和肥大带出现，单侧向前牵引对加力侧的软骨基质合成具有抑制作用，较大的牵引力对抑制作用要强于较轻的牵引力;非加力侧受到的应力性质不同，出现细胞外基质合成加速。

　　【关键词】 牵引， 髁突，Ⅱ型胶原

　　Effect of asymmetry traction on the expression of type Ⅱ collagen in adult rat condyle

　　WU Tuo-jiang, XU Yue, LI Huang, QU Ling-li, CHEN Yang-xi.

　　(Institute of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; Dept. of Orthodontics, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China; Dept. of Endodontics, The Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, Nanjing 210008, China; Dept. of Orthodontics, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective The aim of this investigation was to study the expression of collagen type Ⅱ in the cartilage of mandibular condyle following asymmetric inter-maxillary traction. Methods Two hundred and twenty SD rats were used in this study(one hundred and four rats loading 0.39 N elastic force, another one hundred and four rats loading1.18 N elastic force, while twelve rats for control). The extra-joint device was fixed on the right side by surgery. Half of the experimental group was killed at 3, 7, 14, 28 days. The devices were removed at the 28th day in the rest rats, and the rats were sacrificed at 3, 7, 14, 28 days after removing the device. The type Ⅱ collagen expression levels of all the joints were measured using immunohistochemical techniques. Results The positive expression of the type Ⅱ collagen was mainly observed in the cytoplasm of chondrocyte, especially in maturative and hypertrophic layer. The expression intensity was different in different stages and different sides. Both of the two experimental groups showed the same tendency, while the changes in the light force group were more obviously than the heavy force group. In the right side(force-loading side), the type Ⅱ collagen expression decreased at the early force-loading period. After the device was removed, the expressions increased immediately but then reach the lowest level.The expression almost recovered to normal level at theend of experiment. In the left side(none force-loading side), the expression remained increasing after force-loading and reached the peak at the 14th day.Conclusion These results suggest that even in the adult individuals, the chondrocyte showed reaction to

　　髁突软骨对牵引力的反应直接而又敏感，处于承受负载的前沿位置。髁突软骨与其他关节软骨由透明软骨组成不同，它属于纤维软骨，Ⅱ型胶原是主要的细胞外基质，胶原纤维在关节软骨中排列成网状，中间容纳蛋白质分子，构成具有黏弹性的结构，起到缓冲垫的作用，赋予关节以抗压耐磨的特性。这一特性的维持取决于细胞外基质是否处于稳态。关节在发育、适应外环境和病理变化的过程中，软骨的Ⅱ型胶原发生着相应的变化，通过检测细胞外基质的变化也可以反映出关节对外环境变化的适应与否。本研究通过模拟临床加力过程，检测Ⅱ型胶原的动态变化，旨在探索髁突软骨主要细胞外基质对力学刺激的反应规律。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物模型的建立和标本采集

　　选用10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠220只(四川大学华西医学实验动物中心提供)，体重300 g±25 g，实验前饲养1周，观察无明显全身疾患，无失牙及进食异常，方纳入本实验。将实验动物随机分为轻力组104只、重力组104只、对照组12只，轻力组加载力值0.39 N，重力组1.18 N。各组动物自由饮水，定时摄食，严格控制饲养条件，采用自然光源。实验包括加力阶段和恢复阶段，加力阶段为28 d，恢复阶段为加力后28 d，即实验第29天到第56天。实验加力阶段大鼠在第3、7、14、28天取材，实验恢复阶段大鼠在持续加力28 d后拆除加力装置，在停止牵引后的第3、7、14、28天处死(记为实验的第31、35、42、56天)。对照组在实验结束时处死。实验动物在麻醉状态下，于眶下颧弓处及下颌角处手术固定镍钛拉簧(直径0.25 mm，北京有色金属研究所)，如图1所示，根据分组不同，加载0.39 N和1.18 N力，以测力计确定力值。实验结束时，处死大鼠灌注固定，切取包括下颌骨及关节周边组织(关节囊、翼外肌等)在内的完整颞下颌标本，常规EDTA脱钙至脱钙终点(3~4周)，常规石蜡包埋，制备髁突正中矢状面的切片，片厚4 μm。

　　1.2 Ⅱ型胶原免疫组化染色

　　切片染色用兔多克隆抗体Ⅱ型胶原抗体(武汉Boster公司)，SP免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)。

　　染色步骤如下：石蜡切片脱水和水化后，用PBS(0.01 mol·L-1，pH为7.5±0.1)，冲洗3×3 min。复合酶抗原修复1 h，37 ℃，PBS冲洗3×5 min。每张切片滴加3%过氧化氢50 μL，室温孵育10 min，阻断内源性过氧化酶活性，PBS冲洗3×5 min。除去PBS，每张切片滴加1∶20正常羊血清封闭30 min。除去血清，每张切片滴加50 μLⅡ型胶原一抗(1∶100稀释)，室温孵育60 min。PBS冲洗3×5 min，除去PBS，每张切片滴加50 μL生物素标记羊抗兔IgG二抗，室温孵育10 min，PBS冲洗3×3 min。除去PBS，每张切片滴加50 μL SP复合物37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3×3 min。除去PBS，每张切片滴加100 μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察至显示棕黄色颗粒(约10 min)。自来水冲洗，苏木素复染2 min，自来水冲洗返蓝。梯度乙醇脱水，中性树脂封片。设阴性对照，用PBS代替一抗，其余步骤相同。

　　1.3 图像采集分析和统计

　　使用Leica DMI6000B显微镜, 采用Image-ProPlus 5.0(Media Cybernetics 1993-2003)软件对免疫组化结果在同一参数设置下进行积分光密度值的测量，感兴趣区域(area of interest，AOI)为软骨全层，选择阳性信号时，需扣除软骨以外的区域(图2中绿框以外的区域)和复染的细胞核(图2中的蓝色苏木素染色)，选择的测量目的物为棕黄色的阳性着色颗粒(图2右图中红色标识部分)，测量目标平均光密度(目标平均光密度为标定空白处平均光密度与目标平均灰度之比)，目标颜色越深, 其平均光密度越高[1-2]。每个视野测量3次，取其均数，结果导入SPSS 13.0进行统计分析。

　　2 结果

　　免疫组化结果显示，Ⅱ型胶原阳性信号主要在软骨细胞胞浆表达，在成熟带和肥大带细胞中表达明显。在靠近软骨陷窝的基质和接近皮质终板的地方也有表达，在实验的不同阶段，不同部位的发生表达强度不同(图3)。对结果采用多因素方差分析，将部位和加力阶段对测量结果的影响进行统计分析，部位变量对测量结果具有显著影响(P<0.01)，

　　而加力阶段变量对测量结果的影响无统计学差异(P>0.05)。进一步的统计显示，两组对应的加力侧和非加力侧之间没有显著差异。但轻力组和重力组各组中不同部位间比较有显著差异(表1)。

　　在牵引力加载以后，重力组胶原表达的量变化的幅度不如轻力组明显，但2组相对应的加力侧和非加力侧发生的变化趋势相近——加力侧在加力早期出现表达下调，在去除牵引力后出现表达量的增加，随即又下降到在加力阶段最低的水平，然后逐渐升高。非加力侧表现出表达的上调，2组在第14天达到高峰。去除牵引力后，发生下调，然后都再次升高(图4)。

　　3 讨论

　　关节软骨占软骨干重的一半，是主要的基质成分。髁突软骨中主要是Ⅱ型胶原，占胶原总量的90%，主要由成熟带和肥大带的软骨细胞产生[3-4]，具有促进软骨细胞分化的作用，并为软骨细胞的黏附提供基础[5]。Ⅱ型胶原合成的变化反映了外力对于颞下颌关节的影响和机体对于外力的适应性[6]。通过对Ⅱ型胶原的观察，可以反映髁突软骨细胞功能状态以及机械应力对髁突软骨的影响。髁突软骨是继发生长区，一般认为是青春期矫形治疗的重要作用区域[7]，本研究发现成年个体髁突软骨在外力作用下出现与外力刺激相适应的改变，说明成年个体对关节外力学刺激仍具有一定程度的适应能力。

　　3.1 加力侧的变化

　　Ⅱ型胶原在加力侧的表达从加力后开始持续下降，轻力组在加力2周后，表达开始恢复，而重力组一直维持低水平表达。去除牵引力后，2组加力侧都出现了表达的增强，轻力组的增加幅度明显大于重力组。在去除牵引力后1周，Ⅱ型胶原表达再次减少，从第35天到第56天，2组逐渐恢复表达，最终轻力组表达要强于重力组。2组非加力侧的变化大致相同，轻力组变化的幅度同样大于重力组，在加力阶段均先出现表达增强，再逐渐恢复，在去除牵引力后1周，出现最小的表达量，随即逐渐恢复到接近加力前的水平，最终轻力组表达略强于加力前。加力后加力侧Ⅱ型胶原的改变表明，持续外力对于软骨基质合成有抑制的作用[4，8]，Ⅱ型胶原合成在加力的早期阶段下降[9-10]，然后恢复。较大力量的加载对Ⅱ型胶原的合成具有更强的抑制作用，Ⅱ型胶原表达的减弱提示软骨细胞功能的减退。在去除牵引力后，Ⅱ型胶原合成短期内升高，随即下降，2组在第42天经历一个低值后再次升高。胶原合成的增加可能是与外力消除后，由于肌肉的适应需要一定时间[11]。对抗持续前上牵引的是肌肉向后下方的力量。在失去持续牵引后，这个力量短期内使髁突相对于关节窝发生向后的移位。髁突在含有关节液的密闭关节囊发生移位时，由于液体分子间的吸附作用，产生负压，负压形成的张应力对胶原合成有促进作用[12]。在肌肉应激性的亢进作用消除以后，张应力消失，代之以髁突和关节窝间的压应力，胶原合成再次出现下降。2组在第35天以后，髁突软骨细胞逐渐适应新的应力环境，Ⅱ型胶原合成相应升高。重力组的变化不如轻力组明显，可能与重力造成了髁突软骨细胞损伤有关。

　　3.2 非加力侧的变化

　　加力侧和非加力侧由于受到的力量大小和性质不同，Ⅱ型胶原表达的变化也不同。如果说产生差异的原因是力量的大小，那么受力较小的非加力侧和受力较大的加力侧出现的变化应该类似于重力组加力侧和轻力组加力侧，体现出量的改变，而不是变化趋势的不同。因此，可以推断，加力侧和非加力侧出现差异主要由受力性质的不同产生。非加力侧髁突在含有关节液的密闭关节囊中旋转，由于液体分子间的吸附作用，将产生负压，髁突软骨表面张应力增加，而张应力较之压应力更能促进细胞功能活化[12]。因此，在加力阶段，非加力侧表现出与加力侧相反的变化，Ⅱ型胶原的表达先出现增加，再出现降低。而在去除牵引力后，重力组变化较小，可以推测这和软骨细胞损伤有关。轻力组非加力侧的变化不同，出现的是持续的降低，到第35天以后才逐渐恢复。这可能也和应力性质改变有关，在加力阶段，非加力侧受到的主要是张应力，轻力组非加力侧胶原合成增加一直持续到第14天，此后，随着肌肉的拮抗作用增强，髁突位置回复，出现压应力。去除牵引力后，肌肉应激性的力量增加，在使加力侧髁突后移的同时，非加力侧相对向前移位，发生类似于加力阶段加力侧的改变，髁突软骨受到的压力增加，胶原合成减少。第35天，肌力回复正常后，胶原合成与加力侧一起逐渐增加。

　　应力引起的胶原合成活性的变化是机械信号转化为生物学信号，进而发生细胞功能活动改变的直接体现，二者间存在因果关系。机械信号的转导机制一直都是学者们研究的热点，由于各种调控机制和信号通路间存在交叉和对话，共同形成复杂的网络，对于这个网络的认识还有待深入。

　　【参考文献】

　　[1] 王树党. 图像分析系统中光度学参数——灰度与光密度的应用[J]. 山西医科大学学报, 2003, 34(5)：462. WANG Shu-dang. The utility of opitical parameters in imageanalysis-gray level and optical density[J]. J Shanxi Medical Uni-versity, 2003, 34(5)：462.

　　[2] 吕翔. 病理图像定量分析及其测量误差的控制[J]. 中国体视学与图像分析, 2002, 7(1)：58-62.L?譈 Xiang. Quantitative pathologic image analysis and the control of its measuring errors[J]. Chinese J Stereology Image Analysis,2002, 7(1)：58-62.

　　[3] Visnapuu V, Peltomaki T, Saamanen AM, et al. CollagenⅠandⅡ mRNA distribution in the rat temporomandibular joint regionduring growth[J]. J Craniofac Genet Dev Biol, 2000, 20(3)：144-149.

　　[4] 段小红, 毛勇, 王惠芸, 等. 髁突骨上组织改建中Ⅰ,Ⅱ型胶原的免疫组织化学研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2000, 18(2)：81-84. DUAN Xiao-hong, MAO Yong, WANG Hui-yun, et al. Im-munohistochemical study of type Ⅰ and type Ⅱ collagen in the re-modelling of the supraosseous tissue of mandibular condyle[J].West China J Stomatol, 2000, 18(2)：81-84.

　　[5] 成军. 细胞外基质的分子生物学与临床疾病[M]. 北京： 北京医科大学出版社, 1999：36-47. CHENG Jun. Molecular biology and clinical dieases of extracel-lular matrix[M]. Beijing： Beijing Medical University Press, 1999：36-47.

　　[6] Fujimura K, Kobayashi S, Suzuki T, et al. Histologic evaluationof temporomandibular arthritis induced by mild mechanical load-ing in rabbits[J]. J Oral Pathol Med, 2005, 34(3)：157-163.

　　[7] 李煌, 徐芸, 李松, 等. 下颌功能性后退后青春期恒河猴颞下颌关节间隙的研究[J]. 现代口腔医学杂志, 2004, 18(3)：211-213. LI Huang, XU Yun, LI Song, et al. The study of the change ofthe pubescent Rhesus monkeys′ temporomandibular joint space after functional mandibular retraction[J]. J Modern Stomatol, 2004,18(3)：211-213.

　　[8] Upton ML, Chen J, Guilak F, et al. Differential effects of staticand dynamic compression on meniscal cell gene expression[J]. JOrthop Res, 2003, 21(6)：963-969.

　　[9] Gu Z, Jin X, Feng J, et al. Type Ⅱ collagen and aggrecan mRNAexpressions in rabbit condyle following disc displacement[J]. JOral Rehabil, 2005, 32(4)：254-259.

　　[10] 马军利, 王美青, 张曼, 等. 静压力对髁突软骨超微结构的影响[J]. 口腔医学研究, 2006, 22(6)：588-590. MA Jun-li, WANG Mei-qing, ZHANG Man, et al. Effect of staticstress on the ultrastructure of condylar cartilage[J]. J Oral SciRes, 2006, 22(6)：588-590.

　　[11] 陈发明, 李宁毅, 孙海花, 等. 偏侧咀嚼对大鼠咀嚼肌组织结构的影响[J]. 现代口腔医学杂志, 2003, 17(4)：296-298. CHEN Fa-ming, LI Ning-yi, SUN Hai-hua, et al. The histopa-thologic influence of deflective mastication on mastication mus-cles of white rats[J]. J Modern Stomatol, 2003, 17(4)：296-298.

　　[12] 宋锦璘, 罗颂椒, 樊瑜波, 等. 静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2003, 21(1)：57-60. SONG Jin-lin, LUO Song-jiao, FAN Yu-bo, et al. Static ten-sion-stress effects on proliferation of mandibular condylar chon-drocytes in vitro[J]. West China J Stomatol, 2003, 21(1)：57-60.