牙周韧带细胞植入量与牙周组织再生量关系的动物实验
发表时间：2010-11-18 浏览次数：398次
作者：马忠雄， 闫福华， 钟声 作者单位：福建医科大学口腔医学院，福州 350002
【摘要】目的 将不同数量牙周韧带细胞(PDLC)植入慢性实验性牙周缺损内，观察细胞植入数量与牙周组织再生量的关系，确定可促进牙周组织再生的有效细胞浓度和有效细胞数量。 方法 人工构建4只Beagle犬慢性实验性牙周缺损模型(5 mm×5 mm×3 mm的牙槽骨U型缺损)，分别将载有1×104、1×105和1×106 PDLC的胶原膜植入牙周缺损内。12周后行组织学观察，测量新生牙骨质(NC)长度百分率和新生牙槽骨(NB)面积百分率并行统计学分析。 结果 各组均可见不同程度牙周组织再生，1×104 PDLC组和1×105 PDLC组与对照组比较差别无统计学意义，1×106PDLC组的NB面积百分率较对照组显著增高。 结论 在实验性牙周缺损内植入PDLC，可促进牙周组织再生，其有效浓度为5×107 mL-1，有效数量为1×106 PDLC。
【关键词】 细胞 培养的 牙周膜 牙周组织 引导组织再生 牙周 组织工程
牙周治疗的最终目的是阻止病变进一步发展，并实现牙周组织再生。近年来牙周组织工程的迅速发展为牙周治疗开辟了一条新途径，其种子细胞的选择成为国内外学者关注的热点。牙周韧带细胞(periodontal ligament cells,PDLC)作为牙周组织中的优势细胞，是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，也是牙周炎治疗后形成牙周新附着的主要细胞来源。研究证实,应用自体PDLC移植治疗慢性牙周缺损可显著促进牙周组织再生。但应用多少数量的PDLC才能达到促进再生的目的尚不明确。本实验以Beagle犬为对象，将不同数量的PDLC与载体材料复合后植入动物体内修复慢性实验性牙周缺损，通过组织学观察和测量，评价植入不同数量PDLC对牙周组织再生的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 Beagle犬4只(受试牙24颗)，年龄1岁半，体质量10～15 kg[四川省医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(川)200412]。24颗受试牙随机分为4组。A组：单纯引导性牙周组织再生术(guided tissue regeneration, GTR)组;B组：1×104 PDLC/GTR组;C组：1×105 PDLC/GTR组;D组：1×106 PDLC/GTR组 。
1.1.2 材料及设备 DMEM培养液(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，特级新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)，超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)，CO2孵箱(德国Heraeus公司)，倒置相差显微镜(XDS1A，广州光学仪器厂)，MTT(美国Sigma公司)，离心机(德国Heraeus公司)，生物显微镜(CX31，日本Olympus公司)，BIOGIDE再生膜(美国Osteohealth公司)，酶标仪(德国Human公司)，氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)，瞬康医用胶(北京瞬康医用胶有限公司)，胶原膜(中国医学科学院生物医学工程研究所)。
1.2 方法
1.2.1 实验性牙周缺损的制备 参照文献[1]建立慢性根分叉病变模型：实验动物麻醉后在下颌双侧第2、3、4前磨牙区颊侧制备5 mm×5 mm×3 mm的牙槽骨U型缺损，使颊侧根分叉完全暴露，用刮治器彻底刮除暴露根面的牙周膜，并在缺损处放置牙胶，缝合龈瓣，8周后即形成慢性根分叉病变模型。
1.2.2 犬PDLC培养 采用组织块法，全麻下拔除犬上颌第1前磨牙，刮取根中1/3牙周膜，在饱和湿度、体积分数为0.05的CO2、37 ℃标准环境下孵育。倒置显微镜下严密观察细胞生长状况，待细胞从组织块周围游出并铺满培养板底70%后，用0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA消化，进行传代，取第4代细胞用于实验。
1.2.3 细胞转移 将第4代PDLC分别调整细胞浓度至5×105、5×106和5×107 mL-1，各取20 μL转移到4 mm×4 mm的胶原膜上，即胶原膜上分别有1×104、1×105、1×106个细胞，培养24 h后用于实验。
1.2.4 细胞植入 全麻下常规翻瓣，去除残余牙胶和病变肉芽组织，并在缺损底部相应根面制备切迹作为组织学测量参照点，将复合物按实验分组置于骨缺损处，常规覆盖BIOGIDE膜，膜边缘超出骨缺损边缘2～3 mm，生物胶固定膜，冠方平齐龈缘，然后间断缝合龈瓣。术后3 d肌注庆大霉素8万U/d 。
1.2.5 标本制作及观察 12周后处死动物，取下颌实验牙区颌骨，经固定、脱钙，脱水、浸蜡、包埋，与牙体长轴平行、近远中向切片，苏木素伊红染色(HE染色)。光镜下进行组织学观察和测量：普通光学显微镜下，用多种放大倍数观察试验牙牙周膜、牙骨质、牙槽骨等在形态学上的特征和差异，拍照后以OLYSIA Bioautocell软件测量裸露根面上新生牙骨质(new cementum formation, NC)长度及新生牙槽骨(new alveolar bone formation, NB)面积，计算NC长度百分率和NB面积百分率[2](图1)。
NC长度百分率=NC长度总和两切迹间根面长度×100%
NB面积百分率=NB面积两切迹间缺损面积×100%
a，b为新生牙骨质长度，c为两切迹间根面长度，均为曲线距离
图1 新生牙骨质及新生牙槽骨测量方法示意图(略)
Fig 1 Schematic furcation defect of new cementum (NC) and new alveolar bone formation (NB)
1.3 统计学处理 采用单因素方差分析数据，并进行两两比较。
2 结果
2.1 肉眼观察结果 实验性牙周缺损制备前，动物牙面可见少量牙石和菌斑沉积。缺损模型制成后，可见术区牙龈充血、水肿、牙龈退缩。细胞植入2周后即见牙龈炎症明显消退，12周后各组动物实验牙部位均未见明显牙石，牙龈附着良好;部分实验牙见少量软垢及1～3 mm左右的龈退缩;实验动物健康状况良好。
2.2 组织学观察 在普通光学显微镜下观察试验牙牙周膜、牙骨质、牙槽骨等在形态学上的特征和差异，各实验组和对照组均可见不同程度牙周组织的修复和/或再生(图2)。
NB表现为自根方切迹处向冠方生长，与原有牙槽骨连为一体。NB矿化程度尚较低，其中可见较多骨细胞和成骨细胞，有些部位可见多核巨细胞(图3A)，表明骨组织既有吸收，又有重建;邻近牙周膜侧NB多为板层状排列的束状骨，邻近骨髓侧，骨板由哈弗系统构成，其外周有几层骨板呈同心圆排列，内有血管、神经通过。NC连续或不连续地覆盖于裸露的根面上，厚薄不均(图3B)。新生牙周膜表现为NC和NB之间呈功能性排列的纤维，为平行及斜行方向走形，含较多新生血管(图3C)。少数标本可见炎性细胞浸润区和长结合上皮附着的区域(图3D)，未见根骨固连和牙根吸收现象。
2.3 组织学测量 各实验组和对照组NC长度百分率和NB面积百分率见表1。结果显示：B组和C组的两项检测指标与A组相比，差别无统计学意义(P>0.05)。D组NC长度百分率虽然较对照组略高，但差别无统计学意义(P>0.05);D组NB面积百分率较A，B，C组明显增高，差别有统计学意义(P<0.05)。
PDLC：牙周韧带细胞;GTR：单纯引导性牙周组织再生术;Dt：牙本质;NB：新生牙槽骨. A：GTR组;B：1×104 PDLC/GTR组;C：1×105 PDLC/GTR;D：1×106 PDLC/GTR组.
图2 各组根分叉处愈合情况(HE染色 ×40)(略)
Fig 2 Photomicrographs of furcation defect of group A、B、C、D(HE staining,×40)
NC：NC;PDL：牙周膜. A：箭头示新生牙槽骨区域的多核巨细胞(×400);B：切迹处新生的牙骨质，厚薄不均(×100);C：新生牙周膜(×200);D：部分区域可见炎性细胞浸润，及长结合上皮(白色箭头所示)(×200)
图3 组织缺损修复区常见的病理改变(略)
Fig 3 The general histological changes in the repaired area
表1 各组NC长度和新生牙槽骨面积(略)
Tab 1 Percent of new cementum an new alveolar bone in each group
PDLC：牙周韧带细胞;GTR：单纯引导性牙周组织再生术. A组：GTR组;B组：1×104 PDLC/GTR组;C组：1×105 PDLC/GTR组;D组：1×106 PDLC/GTR组. 与A组比较，☆:P<0.05; 与B组比较，#：P<0.05; 与C组比较，△：P<0.05.
3 讨论
3.1 组织工程与牙周组织再生 组织工程的基本原理是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官病损部位，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的具有正常形态和功能的相应组织、器官，达到修复创伤和重建功能的目的。牙周组织工程包括以下四种基本要素：适当的信号、细胞、血液供给和支架。在损伤愈合和新组织形成过程中，各要素之间相互交联，每一要素都起到极其重要的作用[3]。其中首要的、基本的因素就是细胞。
3.2 植入细胞数量与牙周组织再生的关系 大量研究结果证实，PDLC植入可显著促进牙周组织再生，使PDLC成为牙周组织工程研究的热点之一[46]。虽然有学者已证实PDLC植入可促进牙周组织再生，相关研究的接种密度多介于105～107，但究竟何种接种密度最为适宜还未明确。若植入细胞数量过少，则难以定植于全部根面，无法抑制上皮向下延伸和牙根吸收的发生;若细胞数量过多，容易造成细胞堆积，不利于细胞伸展和成骨潜能的发挥[7]。本实验选择1×104、1×105和1×106PDLC 3个数量组作为研究对象，与载体材料复合后植入动物体内，修复5 mm×5 mm×3 mm慢性实验性牙周缺损。结果显示，与对照组相比，1×106 PDLC组能明显促进本实验性缺损区域牙槽骨的再生。闫福华等在不同浓度骨髓基质细胞修复犬牙周组织缺损的研究中发现，骨髓基质细胞浓度为106及107时更能促进牙周组织再生[8]。上述研究及本实验结果可初步说明细胞植入量为106和/或以上时更易促进牙周组织再生。但尚未明确植入细胞数量与牙周组织再生之间是否存在正相关关系，以及过多细胞是否会产生抑制组织再生的作用。
本研究中，各实验组和对照组均观察到不同程度的牙周组织再生，但各组内部仍存在较大差异，同一组中有些显示仅在缺损的边缘处有部分再生，有些则表现为新生的牙槽骨和新生的牙骨质覆盖整个缺损区。这些差异的形成可能与以下因素有关：首先，受实验条件限制，本研究使用的样本量较小;其次，犬的3个前磨牙根分叉的大小、形态和解剖学结构存在差异，也会直接影响组织再生;第三，GTR术后，由于屏障膜的作用，牙周膜和骨缺损区龈瓣的血供受到影响，若连接区组织越宽越厚，则瓣膜的成活率越高，术后牙龈退缩也越少[9];第四，在牙周组织再生过程中，细胞对局部微环境的变化具有极高的敏感性[10]，各种微小改变都可能产生趋化因子、黏附分子、生长因子、细胞外大分子基质等一系列变化，导致愈合后果的大相径庭[2]。
3.3 牙骨质在牙周组织再生中的作用 牙骨质的形成对牙周组织再生的效果至关重要。大量研究显示，牙周组织再生中新生的牙骨质往往厚度增加，细胞含量丰富，并多以内源性纤维为主，仅少部分区域可见稀疏的外源性Sharpey纤维插入。但另一些以釉基质蛋白衍生物EMD(enamel matrix protein derivative)或EMD与GTR联合修复牙周组织缺损的实验则显示使用EMD可诱导无细胞牙骨质的形成，其结构和功能可能更接近于健康牙周组织。本实验中，既可观察到新生细胞性牙骨质，又可见无细胞性牙骨质，不同实验中NC表现的差异可能反映出牙周组织愈合过程中细胞的活性和胞外基质的成分等均存在明显的异质性，其具体机制尚待进一步研究。
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