量子点荧光技术标记口腔鳞癌细胞中bcl-2的研究

　　作者：盘杰， 赵建江， 王治平， 黄宇华， 陈 军 作者单位：(南方医科大学附属口腔医院∥广东省口腔医院， 广东 广州 510280)

　　【摘要】 【目的】 利用量子点(QD)优良的光学性质对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2进行特异性荧光标记，并与异硫氰酸荧光素(FITC)进行光稳定性比较。 【方法】 分别利用QD605nm和FITC，通过间接免疫荧光法，在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113细胞内bcl-2的表达，并激光连续照射1 h，用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量量子点QD605nm和FITC的荧光信号强度。 【结果】 激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内bcl-2明显表达，量子点QD605标记的荧光信号比FITC更具特异性，且激光连续照射1 h， QD605nm标记的荧光未见明显衰减，而FITC标记的荧光1 h内已基本淬灭。 【结论】 量子点荧光标记技术能对细胞内bcl-2进行标记，比传统的有机荧光具有更显著的优点。

　　【关键词】 量子点; 舌癌Tca8113细胞; bcl-2; 免疫荧光

　　近年来基于半导体量子点(quantum dot，QD)发展起来的生物亲和性功能化的纳米荧光探针，由于其独特的光学性质，QD技术在生物医学领域的应用，尤其在肿瘤学的生物成像技术研究中，前景非常广阔。国外已有将QD运用于乳腺癌细胞膜蛋白的分析及作为研究血液细胞的分子成像工具[1-2]，国内外未见有QD在口腔鳞癌蛋白研究中的报道。我们将QD标记技术引入口腔鳞癌的研究，通过对口腔鳞癌细胞中bcl-2特异性识别，研究bcl-2在口腔鳞癌的发生发展中的作用及量子点的生物学应用，为今后量子点在肿瘤研究中的应用和进一步发展提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　人舌癌Tca8113细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。量子点(QD605nm)标记的链霉亲和素(QDs-SA)试剂盒购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。鼠抗人bcl-2单克隆抗体，生物素化羊抗鼠IgG，羊抗鼠FITC-IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司。RPMI1640培养基和胰蛋白酶向Gibcobro公司(USA)购买。胎牛血清采用杭州四季青公司产品。激光共聚焦显微镜(德国Leica TCS SP2)检测在中山大学生命科学院实验中心进行。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 量子点的荧光和形态观察 用激光共聚焦显微镜观察量子点的发光颜色，发光强度和形态。

　　1.2.2 细胞培养 人舌鳞癌Tca8113细胞株培养于含10℅胎牛血清的RPMI1640培养基中。置于37 ℃﹑体积分数5%的CO2﹑饱和湿度的培养箱中培养，隔日换液，2 ～ 3 d后胰蛋白酶消化细胞后传代。

　　1.2.3 细胞爬片与固定 将无菌盖玻片置于12孔培养板，然后取消化好的细胞按1 × 106/孔接种，培养1 ～ 2 d，细胞长满盖玻片。用0.01 mol/L TBS (pH 7.4)洗涤2次，冰甲醇固定10 min。

　　1.2.4 量子点对舌癌细胞bcl-2蛋白的特异性识别 将固定好的舌癌Tca8113细胞TBS洗涤2次，加入通透液室温孵育10 min， TBS洗涤3次。滴加封闭缓冲液37 ℃湿盒中孵育30 min，加入鼠抗人bcl-2抗体(稀释比1：100，50 μL/孔，阴性对照采用TBS代替一抗) 37 ℃湿盒中孵育1 h，TBS洗涤3次。封闭缓冲液37 ℃湿盒中孵育10 min， 加入生物素化羊抗鼠IgG(稀释比1：100，50 μL/孔) 37 ℃湿盒中孵育45 min， TBS洗涤3次。封闭缓冲液37 ℃湿盒中孵育10 min， 滴加QDs-SA(稀释比1：100，50 μL/孔) 37 ℃湿盒中孵育45 min，TBS洗涤3次。最后取出盖玻片，缓冲甘油封片。

　　1.2.5 FITC对舌癌细胞bcl-2蛋白的特异性识别 洗涤孵育等同1.2.4，二抗改羊抗鼠FITC-IgG(稀释比1：48，50/μL孔)，孵育洗涤后取出盖玻片，缓冲甘油封片。

　　1.2.6 激光共聚焦显微镜下检测与比较 激光共聚焦显微镜观察，参数设置：激发光谱波长488 nm，激光强度100 mW，QD605nm所用发射光滤光片范围是590 ～ 615 nm，FITC所用发射光滤光片范围是505 ～ 530 nm。所用的检测都是在相同的室温共聚焦条件下进行，激光连续激发时间为1 h。在激光共聚焦显微镜下，每5 min自动获取一张图像。荧光强度用Leica Confocal Software测量，重复测量3次，取平均值作为测量结果。平均荧光强度 = 总的荧光强度/细胞数，将其归一化后对QD和FITC进行光稳定性比较。

　　2 结 果

　　2.1 两种标记的Bcl-2形态

　　在激光共聚焦显微镜下量子点为接近圆形的红色荧光，最大发射波长为605 nm。激光共聚焦显微镜下可以清楚的观察到，QD605nm特异性标记的bcl-2在人舌癌Tca8113细胞浆，核膜上均有明显表达，表现为红色荧光，而没有加一抗的舌癌Tca8113细胞检测到QD荧光非常弱且不能显示细胞形态，形成阴性对照。FITC特异性标记的bcl-2在人舌癌Tca8113细胞浆上有明显表达，表现为绿色荧光，在核膜表达不明显(图1)。

　　2.2 QD和FITC光稳定性实验

　　QD红色荧光在高强度共聚焦激光连续激发1 h后荧光无明显减弱，而FITC绿色荧光在共聚焦激光前5 min衰减不明显，从激发5 min后衰减特别明显，1 h内基本淬灭。激光共聚焦显微镜自带的软件测量，在激光照射1 h内将每隔5 min收集到的量子点荧光数据标准后制成图，对QD和FITC进行光稳定性比较(图2、3)。

　　3 讨 论

　　量子点是近年来发现的一种新型荧光标记物，比传统的有机荧光材料具有更优秀的光学特性：激发光谱宽，Stokes位移(激发峰波长和发射峰波长差值)较大(300 ～ 400 nm)[3]。目前研究较多的量子点是由CdSe核心和ZnS外壳组成的壳核结构，直径2 ～ 6 nm。本实验采用链霉亲和素标记的量子点复合物(QDs-SA)，它是亲和素共价结合于QD表面，然后生物素化与生物分子(如蛋白和抗体)结合，结合后所得生物分子与量子点的复合物性质稳定，有利于实验观察。

　　凋亡抑制蛋白bcl-2在口腔鳞癌中高表达，bcl-2蛋白最早是从B细胞淋巴瘤分离出来的癌基因，已经证实bcl-2存在于胞浆，核膜，与细胞的程序化凋亡相关，bcl-2蛋白的过表达可以抑制细胞的凋亡，进而导致肿瘤的发生[4]。本实验以细胞免疫化学的方法对人舌鳞癌Tca8113细胞中的bcl-2进行特异性标记，以同种激光(激发波长488 nm，强度100 mW)激发QD605nm和FITC标记的人舌癌Tca8113细胞的bcl-2，通过激光共聚焦显微镜观测bcl-2表达，FITC标记的bcl-2主要存在于细胞的胞浆，核膜表达不明显，QD605nm标记的舌癌Tca8113细胞中中胞浆和核膜均有高亮度荧光，表明bcl-2主要存在于舌癌细胞的胞浆和核膜，且QD605nm荧光亮度更强。而阴性对照组只见非常弱的荧光。本研究结果提示QD605nm在荧光成像方面有很低的非特异性结合及有较高的荧光信号，可以用于细胞中蛋白的定位检测。此外，QD605nm所用激发波长为488 nm，而不是他的最大激发波长;但是FITC所用激发波长已是它的最大激发波长，因此，可以认为如使用更短的激发波长，QD605nm和FITC间将存在更大的差别[5]。

　　普通的有机荧光染料的荧光寿命很短，光漂白率很快，加上对于激光共聚焦显微镜而言，激光的亮度极高，导致有机荧光染料的荧光衰减更明显，这对需长时间成像的研究来说极为不利[6]。本研究将QD和FITC进行了光稳定性实验，结果显示在激光共聚焦的连续照射1 h中，QD稳定性高，对光漂白的抵抗能力强，荧光寿命长，QD比FITC具有更高的光稳定性，更加适用于需长时间观察或动态观察细胞内的生理变化的研究及观察细胞核内的生理变化。下一步，我们将利用量子点的独特特性对细胞膜上、核膜和胞浆中两种或两种以上蛋白同时成像研究，相信在不久的将来量子点荧光标记技术代替传统的有机荧光，加速生物成像技术的应用和发展。

　　【参考文献】

　　1 Sukhanova A， Devy J， Venteo L， et al. Biocompatible fluorescent nanocrystels for immunolabelingof membrane proteins and cells [J]. Anal Biochem， 2004，324(1)：60-67.

　　2 Garon EB， Marcu L， Luong Q， et al. Quantum dot labeling and tracking of human leukemic，bone marrow and cord blood cell [J]. Leuk Res， 2007，31(5)：643-651.

　　3 Hanaki K， Mono A， Oku T， et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long life and highly photostabable endosome marker[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2003，302(3)：496-501.

　　4 Staibano S， Mignogna MD， Lo Muzio L， et al.Overexpression of cyclin-D1， bcl-2，and bax proteins， proliferating cell nuclear antigen (PCNA)， and DNA-ploidy in squamous cell carcinoma of the oral cavity[J]. Hum Pathol， 1998，29(11)：1189-1194.

　　5 Wang ZH， Wang YH， Liang QR， et al. Detection of tumor marker CA125 in ovarian carcinoma using quantum dots [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2004，36(10)：681-686.

　　6 Li Z， Wang K， Tan W， et al. Immunofluorescent labeling of cancer cells with quantum dots synthesized in aqueous solution [J]. Anal Biochem， 2006，354(2)：169-174.