高氟对小鼠磨牙牙胚发育的影响

　　作者：侯铁舟，陶洪，朱丰燕，王帅帅 作者单位：西安交通大学医学院：1. 附属口腔医院口腔内科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院口腔科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨高氟环境对小鼠磨牙牙胚发育的影响。方法 建立小鼠急性氟中毒动物模型，采用HE染色方法，观察高氟环境下颌第一磨牙牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状形态发生期、分化期、分泌期、成熟期成釉细胞形态的变化，并同时观察正常对照小鼠的牙胚发育情况。结果 对照组磨牙发育为钟状期时，实验组仍处于帽状期。实验组钟状分化、分泌期成釉细胞细胞变矮，部分细胞极性消失，细胞排列紊乱。结论 过量氟的摄入可使磨牙发育明显延迟。过量氟对钟状分化、分泌期成釉细胞的细胞形态有较强影响。

　　【关键词】 牙胚发育;氟中毒;磨牙

　　(1. Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Dentistry Department, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To study the tooth germ development of mouse molar in fluorosis. Methods We established an acute fluorosis model and used HEstaining after preparing specimens of different stage of mouse first molar developing tooth germ. Results The developing molars of the control fetuses were at the bell stage of odontogenesis, whereas those of the experimental population were at cap stage. The ameloblasts became shorter and lost polarity. The arrangement of ameloblasts fell into disorder at the bell of differeiational stage and secretory stage. Conclusion The developing molars of the experimental fetuses were retarded. Highdose fluoride has a strong effect in the ameloblasts at the bell of differetiational stage and secretory stage.

　　KEY WORDS: tooth germ development; fluorosis; molar

　　氟牙症形成于釉质发育的分泌期还是成熟期，一直是学术界争议的问题[12]。由于鼠磨牙与人类牙齿的生长、发育极其相似，是研究人牙胚发育的极好模型。本研究与以往不同的是，将观察的着重点放在牙胚发育形态变化最为活跃的钟状期，根据成釉细胞形态变化将钟状期划分为钟状形态发生初期、钟状分化期、钟状分泌期、钟状成熟期四个阶段。通过对小鼠磨牙发育模式的观察，以期对氟在小鼠牙胚发育中的作用获得较为系统、全面、更加深入的认识。

　　1 材料与方法

　　1.1 急性氟中毒动物模型的建立及实验分组 氟牙症动物模型的建立参照SMID等[3]的方法。通过预实验，筛选出对小鼠既有毒性作用又不致死的剂量10mg/kg NaF用作实验剂量。

　　60只怀孕昆明种小鼠(第四军医大学中心动物实验室提供)，孕期为9.5d时，体重平均(40±1.0)g，随机分为2组。实验组孕鼠30只，腹腔注射10mg/kg NaF/次(西安化学试剂厂生产);对照组小鼠30只，腹腔注射等量的生理盐水。隔6h 1次，每天2次，连续注射3d。常规饲料喂养和自来水饮水。

　　1.2 标本制备 在孕期13.5d(E13.5)、15.5d(E15.5)、18.5d(E18.5)、出生后1d(PN1)、3d(PN3)、5d(PN5)、7d(PN7)，上述7个时间点取胎鼠及新生小鼠头部，40g/L多聚甲醛4℃固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，冠状定位制备5μm连续切片。每间隔5片取1片，贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，用于HE染色。应用常规的光学显微镜观察小鼠下颌第一磨牙牙胚HE染色。

　　2 结 果

　　E13.5实验组：牙板上皮在出牙点未见形成圆形或卵圆形上皮芽。对照组：磨牙牙胚处于蕾状期。牙板上皮在出牙点形成圆形或卵圆形上皮芽，成釉器细胞，呈立方或矮柱状，胞核大，胞质少。其下方和周围的外胚间充质细胞在成釉器头端明显增殖，密集在一起包绕着上皮芽。

　　E15.5实验组：磨牙牙胚处于蕾状期。牙板上皮在出牙点形成圆形或卵圆形上皮芽，成釉器细胞，呈立方或矮柱状，胞核小，染色深。对照组：磨牙牙胚处于帽状期。成釉器分为三层：外釉上皮层、内釉上皮层和星网状层。成釉器下方的球形细胞凝聚区是牙乳头，包绕成釉器和牙乳头边缘的外胚间充质细胞，密集成结缔组织是牙囊。

　　E18.5实验组：磨牙牙胚处于帽状期。成釉器为外釉上皮层、星网层、内釉上皮层三层结构。核深染(图1A)。对照组：磨牙牙胚处于钟状形态发生期。成釉器为外釉上皮层、星网层、中间层、内釉上皮层四层结构。内釉上皮细胞沿基底膜整齐排列(图2A)。

　　PN1实验组：磨牙牙胚处于钟状形态发生期。成釉器为外釉上皮层、星网层、中间层、内釉上皮层四层结构。核深染。与对照组同期相比，内釉上皮细胞排列未见明显变化(图1B)。对照组：磨牙牙胚处于钟状分化期。内釉上皮细胞分化为前成釉细胞，细胞变长，呈柱状，胞核向中间层方向移动，内釉上皮正在极化。前成釉细胞紧密相连，排列一致，细胞形态正常(图2B)。

　　PN3实验组：磨牙牙胚处于钟状分化期。与同期对照组相比，前成釉细胞变短，部分细胞极性消失，细胞之间出现裂隙，排列紊乱(图1C)。对照组：磨牙牙胚处于钟状分泌期。内釉上皮细胞进一步分化为成釉细胞呈长柱状，细胞进一步极化，胞核位于远离基底膜的一端，成釉细胞紧密相连，整齐排列(图2C)。

　　PN5实验组：磨牙牙胚处于钟状分泌期。与同期对照组相比，部分成釉细胞之间裂隙加重，极性消失，排列更加紊乱。少数成釉细胞与基底膜分离(图1D)。对照组：磨牙牙胚处于钟状成熟期。内釉上皮完全极化。在基底膜的内侧，有前期牙本质、牙本质形成。已形成的牙本质外表面有牙釉质形成(图2D)。

　　PN7实验组：磨牙牙胚处于钟状成熟期。成釉细胞与釉质之间多处出现空泡，使成釉细胞与釉质分离。对照组：牙釉质、牙本质进一步形成、矿化。此外，实验组成釉器的外釉上皮层、星网层、中间层以及牙乳头细胞、成牙本质细胞与对照组相比，细胞形态及排列未见明显改变。

　　3 讨 论

　　本实验发现，过量氟的摄入可使磨牙发育明显延迟。对照组磨牙发育为钟状期时，实验组仍处于帽状期。出生后，对照组已有牙本质、牙釉质形成，而同期实验组发育滞后。推测过量氟可能干扰了发育中的牙胚上皮和外胚间充质之间的相互作用。

　　本实验观察到对照组小鼠磨牙牙胚从E15.5d到PN7d内釉上皮细胞经过一系列复杂的分化发育过程后达到终末分化细胞，即成釉细胞。分泌期成釉细胞经历了从分泌前期成釉细胞、分泌早期成釉细胞、分泌末期成釉细胞的转变。PN1d磨牙牙胚处于钟状分化期，分泌前期成釉细胞处于增殖分化。PN3d磨牙牙胚处于钟状分泌期，分泌期成釉细胞的特征是细胞呈高柱状，细胞核远离基底膜，呈典型的极性倒置，成釉细胞的远端出现功能性的突起——托姆氏突起(Tomes process)。Tomes突起的形成是分泌期成釉细胞的特征，细胞合成和分泌的釉基质沿着Tomes突起不断沉积。而此时期实验组结果显示过量氟对钟状分化、分泌期成釉细胞的细胞形态产生了强的影响。成釉细胞变矮，部分细胞失去正常的紧密相连，细胞之间出现裂隙;细胞极性消失，细胞排列紊乱。成釉细胞处于成熟期，成釉细胞与釉质之间多处出现空泡，使成釉细胞与釉质分离，牙尖处可见成釉细胞下囊腔形成。由于细胞处于高分化和分泌状态，对任何刺激都非常敏感。所以过量氟使受损的分泌期成釉细胞变短、极性消失，出现细胞排列紊乱，Tomes突起变短或消失。正常釉柱和柱间质结构丧失，甚至引起成釉细胞下囊腔的形成。因此，分泌期成釉细胞失去了正常的分泌功能，导致釉基质分泌减少或停止。在萌出后受损的成釉细胞相应位置的牙面上出现釉质发育不全性缺损，并且分泌期成釉细胞受损程度与釉质发育不全的缺损程度成正比[45]。本实验与以往的研究结果基本一致[2]。但以往的研究主要用小鼠的切牙，鼠切牙是连续萌出的，与磨牙的发育截然不同。由于鼠磨牙与人类牙齿的生长、发育极其相似，是研究人牙胚发育的极好模型。但是各个发育期磨牙胚标本的制作有一定的难度，本实验在这方面做了一定的工作，首次连续观察氟中毒时不同发育时期鼠磨牙成釉细胞的形态改变，为进一步探讨氟牙症发病机制提供第一手的实验资料。

　　【参考文献】

　　[1]MACIEJEWSKA I, ADAMOWICZKLEPALSKA B. Influence of low and high doses of fluoride on tooth germ development in rats [J]. Folia Morphol (Warsz), 2000, 59(4):307310.

　　[2]MILHAUD GE, CHARLES E, LOUBIERE ML, et al. Effects of fluoride on secretory and postsecretory phases of enamel formation in sheep molars [J]. Am J Vet Res, 1992, 53(3):12411247.

　　[3]SMID JR, MONSOUR PA, HARBROW DJ, et al. A histochemical study of the effects of high doses of sodium fluoride on dipeptidy peptidase activity in the rat incisor ameloblast [J]. Arch Oral Biol, 1990, 35(8):671675.

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　　[5]MUHITTIN T, EBRU C, MURAT T, et al. Bond strength of glassceramics on the fluorosed enamel surfaces [J]. J Dent, 2008, 36(4):281286.