醛固酮促进心肌成纤维细胞增殖的实验研究

　　作者：江琼1, 2 ，洪华山3 ，陈建华1, 2 作者单位：1.福建医科大学附属协和医院心内科，福建 福州 350001; 2.福建省冠心病研究所;3.福建医科大学附属协和医院干部病房

　　【摘要】 目的：研究醛固酮对培养心肌成纤维细胞增殖的影响。方法：培养新西兰白兔心肌成纤维细胞，将第三代心肌成纤维细胞分为醛固酮组(不同浓度)、醛固酮+螺内酯组和对照组，心肌成纤维细胞的代谢活性与DNA合成分别用WST-1试剂和5′溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)酶联免疫吸附试验(ELISA)进行测定。结果：与对照组比较，不同浓度醛固酮作用后，心肌成纤维细胞的WST-1与BrdU的OD值均增加，并呈浓度依赖性(P<0.05～<0.01);而螺内酯+醛固酮组的WST-1与BrdU的OD值明显低于醛固酮组(P<0.01)。结论：在体外，醛固酮能诱导心肌成纤维细胞增殖，而螺内酯抑制其作用。

　　【关键词】 醛固酮,心肌,成纤维细胞,螺内酯

　　Abstract：Objective:To investigate the effect of aldosterone on the proliferation of cultured myocardiac fibroblasts in vitro.Methods:Myocardiac myofibroblasts derived from the heart of New Zealand rabbit were cultured.The 3rd passage of cells were divided into the following groups: aldosterone groups (in different concentration), aldosternoe+spironolactone group and control group.Both of cells metabolic activity and DNA synthesis were evaluated with WST-1 cleavage and BrdU incorporation assay (ELISA).Results: Compared with the control group, the OD values of both WST-1 and BrdU assay were significantly increased in a manner of dosedependent pattern in aldosterone groups(P<0.05).However, the OD of WST-1 and BrdU in aldosternoe+spironolactone group was lower than that in aldosterone groups(P<0.01).Conclusion:Aldosterone can promotes the proliferation of cultured myocardiac fibroblasts in vitro.The effect of aldosterone can be blocked by spironolactone.

　　Author′s　address： Department of Cardiology, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou,Fujian,350001,China

　　Key words：Aldosterone; Myocardium; Fibroblasts; Spironolactone

　　心肌成纤维细胞约占正常心肌组织细胞总数的60%～70%，其增殖以及合成细胞外基质增加将导致心肌纤维化 [1，2] 。醛固酮致心肌纤维化机制的研究主要集中在其促进心肌成纤维细胞胶原合成方面，有关醛固酮对心肌成纤维细胞增殖作用的研究很少。本研究以培养的新西兰白兔心肌成纤维细胞为模型，以醛固酮为干预因素，探讨其对心肌成纤维细胞增殖的作用，进一步揭示醛固酮促心肌纤维化的机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 主要材料

　　成年纯种新西兰白兔购自福建省兔类动物重点实验室(合格证号：闽实动系准第01-19号);醛固酮购自Sigma公司;螺内酯粉剂由江苏宜兴前进制药厂惠赠;细胞增殖酶联免疫吸附(ELISA)5′ 溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)试剂盒、细胞增殖WST-1试剂盒均购自Roche公司。

　　1.2 心肌成纤维细胞的培养和鉴定[3]

　　无菌条件下，取新鲜成年健康新西兰白兔左心室，剪碎成1 mm3碎片，以贴块培养法进行原代培养，待细胞融合后进行传代培养和细胞鉴定，取第三代细胞进行实验。

　　1.3 实验分组

　　对照组、不同浓度的醛固酮组(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)和醛固酮(10-7mol/L)+螺内酯(2.5×10-5mol/L)组。

　　1.4 以4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝苯基)-2氢-5-四氮唑]-1,3-苯磺酸钠(WST-1)试剂、BrdU ELISA同步测定细胞活性及DNA掺入[4]。严格按说明书操作，简述如下：以均匀密度(5×105/ml)接种第三代传代培养的心肌成纤维细胞于96孔板中(Nunc Denmark产品)，细胞生长至50%融合状态后，改用无血清IMDM培养液(GIBCO公司)静止培养24h，然后分别加入各干预因素作用24h。每孔加入10μl的100μmol/L无菌BrdU标记液(终浓度为10μM)，置CO2培养箱(2300 SHE L-LAB，美国)孵育9h后，每孔加入10μl的100μmol/L即用型WST-1溶液，继续孵育3h。取出培养板，置振荡器上充分振荡(300 r/min)1min，在酶标仪(AWARENESS Star Fax-2100，美国)450/630nm双波长处检测OD值，即WST-1检测值。充分倾出上述培养板中液体， 以FixDenat液固定和使DNA变性后，加入Anti-BrdU-辣根过氧化物酶(POD)，置工作液于室温孵育90min。以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入即用型酶作用底物显色约20min，每孔加入25μl的1mol/L硫酸终止反应。立即在酶标仪450/630nm双波长处检测OD值，即BrdU检测值。每组重复3孔，实验另设2个空白对照孔(无细胞，仅含IMDM培养液)和1个背景对照孔(含细胞，但不加WST-1/BrdU标记液)，上述对照孔吸光值均应<0.1。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS 12.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度醛固酮对心肌成纤维细胞增殖的影响

　　从表1中可看出，醛固酮使成纤维细胞的WST-1代谢活性及BrdU掺入增加，并且在10-10mol/L～10-7mol/L范围内呈现量效关系(P<0.05～<0.01)。表1 醛固酮对心肌成纤维细胞代谢活性和DNA合成的影响注：与对照组比较△ P<0.05 ，△△P<0.01;与10-10mol/L组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01;与10-9mol/L比较##P<0.01;与10-8mol/L比较★★P<0.01。

　　2.2 螺内酯对心肌成纤维细胞增殖的影响

　　从表2中可看出，浓度为2.5×10-5mol/L的螺内酯可明显抑制心肌成纤维细胞的WST-1代谢活性及BrdU掺入量(P<0.01)。表2 螺内酯对心肌成纤维细胞代谢活性和DNA合成的影响注：与对照组比较△△P<0.01;与醛固酮(10-7mol/L)组比较▲▲P<0.01。

　　3 讨 论

　　心肌纤维化参与多种急慢性心血管疾病的病理过程，是导致心室顺应性和收缩功能下降而发生泵衰竭的一个重要因素。心肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要效应细胞，其增殖和胶原合成积聚过多是心肌纤维化的主要病理基础。醛固酮在心肌纤维化中作用的研究始于上世纪90年代，体外研究发现，醛固酮能够促进培养的成年大鼠心脏成纤维细胞的胶原合成[4]。而有关醛固酮对心肌成纤维细胞增殖作用的研究却很少。

　　本研究以第三代传代培养的新西兰白兔心肌成纤维细胞为实验模型，采用不同浓度的醛固酮进行干预，应用本室建立的WST-1、BrdU ELISA同步测定心肌成纤维细胞代谢活性与DNA合成的方法[5]，探讨醛固酮对心肌成纤维细胞增殖的作用。结果显示，醛固酮可使体外培养的心肌成纤维细胞DNA合成增加及其WST-1的代谢活性增强，并在10-10～10-7mol/L浓度范围内呈剂量依赖性，表明醛固酮可刺激心肌成纤维细胞的增殖。而与醛固酮(10-7mol/L)组相比，醛固酮(10-7mol/L)+螺内酯(2.5×10-5mol/L)组心肌成纤维细胞的DNA合成及其代谢活性则显著降低(P<0.01)，表明醛固酮拮抗剂——螺内酯能明显抑制醛固酮促心肌成纤维细胞增殖的作用。

　　肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在心血管事件链中起重要作用，循证医学证明RASS抑制剂对心肌梗死或慢性心力衰竭的心室重构和心肌纤维化有重要的作用[6，7]，但其机制没有完全清楚。本研究结果提示醛固酮促心肌成纤维细胞增殖可能是心血管疾病过程中心肌纤维化的机制之一，而醛固酮拮抗剂——螺内酯能拮抗醛固酮的促增殖作用，为临床应用螺内酯治疗慢性收缩性心衰提供了实验依据。

　　【参考文献】

　　[1]Meckert PC, Rivello HG, Vigliano C, et al. Endomitosis and polyploidization of myocardial cells in the periphery of human acute myocardial infarction[J] .Cardiovasc Res, 2005, 67(1)：116-123.

　　[2]Rosenkranz S. TGFbeta1 and angiotensin networking in cardiac remodeling[J] .Cardiovasc Res, 2004, 63(3)：423-432.

　　[3]陈建华，洪华山，江 琼，等.心脏成肌纤维细胞的培养及其表型[J] .福建医科大学学报，2005，39(1)：27-29.

　　[4]Sappino AP, Schurch W, Gabbiani G, et al. Differentiation repertoire of fibroblastic cells: expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic modulation[J].Lab Invest, 1990, 63：114-161.

　　[5]Hong H, Chen F, Chen Z, et al. Simultaneous measurement of VSMCs metabolic activity and proliferation with WST-1 and cell proliferation ELISA (BrdU)[J].Biochemica, 2001,(3)：24.

　　[6]毛艳华，张莉娜，石斗飞，等.螺内酯对老年人轻度心力衰竭心肌纤维化和心功能的影响[J].心血管康复医学杂志，2007，16(1)：57-60.

　　[7]邓 玮，卢利群，陈庆伟.咪达普利和安体舒适干预心肌纤维化大鼠血管紧张素Ⅱ的产生[J].心血管康复医学杂志，2006，15(2)：132-135.