细胞因子对人冠脉平滑肌细胞PAPPA、MMP3、TIMP1基因表达的影响

　　作者：夏爱祥 张清华 蒋知新 方效民 姜同学 林虎 梁雪梅 作者单位：解放军第305医院老年病中心，北京 100017

　　【摘要】 目的 探讨细胞因子白细胞介素(IL)1β、IL6对人冠脉平滑肌细胞中妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)基因表达的影响。方法 应用相同浓度IL1β(20 μg/L)、IL6(10 μg/L)各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养0、2、4、8、24、36 h后收集细胞。应用不同浓度IL1β(0、5、20、40 μg/L)、IL6(0、5、10、50 μg/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养6h后收集细胞。应用实时定量PCR的方法检测细胞内PAPPA、MMP3、TIMP1基因表达量。结果 同剂量IL1β刺激下，MMP3和PAPPA基因表达量在2 h时开始发生上调，8 h左右达高峰，而后开始下降;而TIMP1表达量在2 h时开始发生下降，8h左右达最低，而后开始上升。在不同剂量IL1β刺激下，MMP3、PAPPA基因表达量随着剂量加大呈上升趋势(MMP3：r=0.907，P=0.000;PAPPA：r=0.972，P=0.000),TIMP1呈下降趋势(r=0.768，P=0.004)。不同剂量组MMP3、TIMP1、PAPPA表达量具有显著性差异(MMP3：F=24.047，P=0.000;TIMP1：F=33.737，P=0.000;PAPPA：F=264.699，P=0.000)。MMP3在20 μg/L和40 μg/L组间没有显著性差异(P=0.154);TIMP1仅40 μg/L组和其他组间具有显著性差异，其余组间无显著性差异(P=0.383);PAPPA在各组间均有显著性差异。在同剂量IL6的刺激下，MMP3、PAPPA表达量随时间变化趋势和IL1β相似，而TIMP1则在4 h时就达到最低，随后开始上升。在不同剂量IL6刺激下，MMP3、PAPPA亦有随剂量加大表达量上升趋势(MMP3：r=0.919，P=0.000;PAPPA：r=0.941，P=0.000)，TIMP1呈下降趋势(r=0.799，P=0.002)。不同剂量组MMP3、TIMP1、PAPPA表达量均有显著性差异(MMP3：F=14.081，P=0.001;TIMP1：F=5.727，P=0.022;PAPPA：F=25.128，P=0.000)。MMP3在5 μg/L和10 μg/L组间没有显著性差异(P=0.292);TIMP1对照组与10 μg/L和50 μg/L组间具有显著性差异，其余各组间没有显著性差异(P=0.253);PAPPA 基因表达量在5 μg/L和10 μg/L组没有显著性差异(P=0.065)。结论 炎症因子IL1β、IL6对冠脉平滑肌细胞中斑块稳定相关标记物PAPPA、MMP3、TIMP1表达的影响，可能是炎症在急性冠脉综合征发生发展中作用机制之一。

　　【关键词】 急性冠脉综合征,白细胞介素1β,白细胞介素6,妊娠相关血浆蛋白A,基质金属蛋白酶3;基质金属蛋白组织抑制剂1

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of IL1β and IL6 on pregnancyassociated plasma protein (PAPP)A, MMP3, TIMP1 gene expression in human coronary artery smooth muscle cells. Methods Human coronary artery smooth muscle cells were stimulated with IL1β (20 μg/L) or IL6 (10 μg/L) to isolate RNA and collect culture media after 0, 2, 4, 8, 24 and 36 h. Then human coronary artery smooth muscle cells were stimulated with IL1β (0, 5, 20, 40 μg/L) or IL6(0, 5, 10, 50 μg/L) respectively to isolate RNA and collect culture media after 6 h. Realtime PCR was performed on RNA to detect gene expression. Results In the same concentration of IL1β, MMP3, PAPPA mRNA expressions were upregulated at 2 hour，at 8 hour the expression reached the peak, then began to descend; TIMP1 mRNA expression was downregulated at 2 hour，the mRNA expression got to the lowest at 8 hour, then began to go up. In different concentration of IL1β, MMP3, PAPPA mRNA expression was upregulated with the dose(MMP3：r=0.907，P=0.000;PAPPA：r=0.972，P=0.000), and TIMP1 mRNA expression was downregulated with the dose (r=-0.768，P=0.004). There were significant difference in mRNA expression among different groups (MMP3：F=24.047，P=0.000;TIMP1：F=33.737，P=0.000;PAPPA：F=264.699，P=0.000). There were no significant differences of MMP3 between 20 and 40 μg/L groups (P=0.154). But there was significant difference of TIMP1 mRNA expression only between 40 μg/L and other groups;In the same concentration of IL6, MMP3, PAPPA mRNA expression was upregulated at 2 hour，at 8 hour the expression reached peak, then began to descend; TIMP1 mRNA expression was downregulated at 2 hour，the mRNA expression got to the lowest at 4 hour, then began to increase. In different concentration of IL6, MMP3, PAPPA mRNA expression was upregulated with the dose(MMP3：r=0.919，P=0.000;PAPPA：r=0.941，P=0.000), and TIMP1 mRNA expression was downregulated with the dose (r=-0.799，P=0.002). There were significant difference in mRNA expression among different groups (MMP3：F=14.081，P=0.001;TIMP1：F=5.727，P=0.022;PAPPA：F=25.128，P=0.000). There were no significant differences of MMP3, PAPPA mRNA between 5 and 10 μg/L groups (MMP3: P=0.292;PAPPA: P=0.065). There were significant differences of TIMP1 mRNA expression between control and 10, 50 μg/L groups. Conclusions IL1β and IL6 can promote PAPPA, MMP3 gene expression and inhibit TIMP1 gene expression in human coronary artery smooth muscle cells, and it may be one of the mechanisms of inflammation effect in acute coronary syndrome.

　　【Key words】 Acute coronary syndrome; Interleukin1β; Interleukin6; Pregnancyassociated plasma proteinA; Matrix metalloproteinase3; Tissue inhibitor of metalloproteinase1

　　研究表明，炎症反应所致易损斑块的破裂是急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)病理过程中最重要的始动因素〔1〕，但其具体作用机制尚不清楚。基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)是一组锌离子依赖性的蛋白水解酶超家族，是细胞外基质降解及重构的重要介质，对动脉粥样硬化斑块的稳定性及破裂具有非常重要的作用。对ACS犯罪血管的局部病理研究表明炎症和MMP家族高表达具有一致性，提示两者之间具有某种相关性。本文应用炎症因子白细胞介素(IL)1β、IL6刺激人冠脉平滑肌细胞，观察其中妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA)、MMP3及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)的表达变化，从而探讨炎症在ACS中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人冠状动脉平滑肌细胞〔HCASMC〕(Casecade公司)。试剂：231培养基、培养基添加剂及胰酶(Casecade公司)，IL1β、IL6(PeProtech公司)，MMLV Reverse Transcriptae、Trizol Reagent(Invitrogen，USA)，RNasin Ribonuclease Inhibitor、Agarose、Set of dATP，dCTP，dGTP，dTTP(Promega，USA)，Oligo(dT)1518 Primer(上海生工生物科技有限公司),Taq DNA Polymerase、Loading Buffer(TaKaRa，Japan)，溴化乙锭(Sigma，USA)，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems，USA)。仪器： MCO17AICO2恒温培养箱(SANYO，Japan)、CK2型倒置显微镜(Olympus，Japan)、超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)、Ultrospec 3100 pro型紫外分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech，UK)、DYC31D型电泳仪(北京六一仪器厂)、GELDOC2000型紫外凝胶成像系统(BioRad，USA)、PTC200 PCR 扩增仪(MJ，USA)、MicroAmpR○Optical 96Well Reaction Plate、MicroAmpR○96WellFull Plate Cover、ABI PRISMTMOptical Cover Compression Pads、7500型实时定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems，USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及因子刺激 细胞在37℃，含95%空气和5%CO2的培养箱中培养。实验用5～7代的细胞。将细胞按2.5×105/瓶接种于25 cm2的培养瓶中，24 h后换液，细胞接近80%融合时加入因子进行刺激。应用20 μg/L的IL1β、10 μg/L的IL6各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养0、2、4、8、24、36 h后收集上清液和细胞。应用不同浓度的IL1β(0、5、20、40 μg/L)、IL6(0、5、10、50 μg/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，6 h后收集上清液和细胞。上清液-70℃冻存，细胞用生理盐水冲洗2遍后用Trizol消化，实验重复2次。

　　1.2.2 细胞总RNA提取 采用细胞总RNA Trizol试剂提取RNA，严格按照试剂说明书进行操作。

　　1.2.3 细胞总RNA质量及纯度检验 ①每份样品取4 μl稀释至400 μl，测定其A260 nm/A280 nm吸光度比值均在1.8～2.0。②取稀释后的RNA 1 μl在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，可见RNA清晰的18 S和28 S的条带，无弥散。

　　1.2.4 cDNA的合成 取5 μl总RNA进行逆转录反应，严格按照MMLV逆转录酶说明书进行操作。

　　1.2.5 实时定量PCR PAPPA、MMP3、TIMP1引物应用软件(primer5和oligo6)自行设计，长度为141 bp、186 bp、198 bp;PAPPA：F：5′GAGGAGTTGGCAGGAGTAGCA3′;R:5′GCCCAGGCTGGCTGTGACCAAT3′;MMP3：F：5′TATGGACCTCCCCCTGACTCC3′，R：5′AGGTTCAAGCTTCCTGAGG3′;TIMP1：F：5′TCATCAGGGCCAAGTTCGTG3′，R：5′GAAACTCCTCGCTGCGGTTGT3′(北京赛百胜科技有限公司)。反应条件如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 65 s，共50个循环。

　　1.3 统计学方法 应用SPSS10.0软件进行统计学描述与分析，所得数据用x±s表示，不同时间基因表达量应用Excel软件作出变化趋势图，多组间比较用oneway ANOVA分析，两两比较应用SNK法检验，并进行基因的表达量和因子剂量之间Spearman相关分析。

　　2 结果

　　2.1 IL1β致目的基因的表达情况 同剂量IL1β刺激下，MMP3和PAPPA基因表达量在2 h时开始发生上调，8 h左右达高峰，而后开始下降;而TIMP1表达量在2 h时开始发生下降，8 h左右达最低，而后开始上升(图1)。在不同剂量IL1β刺激下，MMP3、PAPPA基因表达量在实验剂量范围内随着剂量加大呈上升趋势(MMP3：r=0.907，P=0.000;PAPPA：r=0.972，P=0.000),TIMP1呈下降趋势(r=-0.768，P=0.004)。不同剂量组MMP3、TIMP1、PAPPA表达量具有显著性差异(MMP3：F=24.047，P=0.000;TIMP1：F=33.737，P=0.000;PAPPA：F=264.699，P=0.000)(表1)。MMP3在20 μg/L和40 μg/L组间基因表达量没有显著性差异(P=0.154)，其余各组间均有显著性差异;TIMP1表达量仅40 μg/L组和其他组之间具有显著性差异，其余组间无显著性差异(P=0.383);PAPPA表达量在各组间均有显著性差异。

　　表1 IL1β致目的基因表达的剂量效应(略)

　　2.2 IL6致目的基因的表达情况 同剂量IL6的刺激下，MMP3、PAPPA表达量随时间变化趋势和IL1β相似，而TIMP1则在4 h时就达到最低，随后开始上升(图2)。不同剂量IL6刺激下，MMP3、PAPPA随剂量加大表达量上升趋势(MMP3：r=0.919，P=0.000;PAPPA：r=0.941，P=0.000)，TIMP1呈下降趋势(r=-0.799，P=0.002)。不同剂量组MMP3、TIMP1、PAPPA表达量均具有显著性差异(MMP3：F=14.081，P=0.001;TIMP1：F=5.727，P=0.022;PAPPA：F=25.128，P=0.000)(表2)。MMP3在5 μg/L和10 μg/L组间表达量没有显著性差异(P=0.292);TIMP1对照组与10 μg/L和50 μg/L组间具有显著性差异，其余各组间均没有显著性差异(P=0.253);PAPPA 基因表达量在5 μg/L和10 μg/L组没有显著性差异(P=0.065)，其余各组间均有显著性差异。

　　表2 IL6致目的基因表达的剂量效应(略)

　　图1 IL1β致基因表达的时间效应(略)

　　图2 IL6致基因表达的时间效应(略)

　　3 讨论

　　MMPs是一组依赖于Zn2+的蛋白酶超家族，对细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)成分有较高亲和力,几乎可降解所有ECM成分。近来研究发现，MMPs在不稳定斑块中表达明显，降解ECM，使纤维冒变薄，致使斑块不稳定性增加，对ACS的发生发展具有非常重要的作用〔2〕。1998年,Kai〔3〕首次报道在AMI和不稳定型心绞痛组中MMP2水平比稳定型心绞痛组及对照组高两倍。MMP9在不稳定型心绞痛组中最高,其次为AMI组。而且其升高与AMI时血清磷酸肌酸激酶(CK)和其同工酶(CKMB)升高不相关。Blankenberg等〔4〕对冠心病病人进行MMP9的血浆浓度及基因多态性与预后的相关分析,认为血浆MMP9浓度与心血管事件的死亡率呈正相关,可以作为预测冠心病心血管事件死亡率的新的指标。在众多的MMPs中，MMP3显得尤为重要，因为其底物广泛，可以单独降解构成ECM的大部分成分，同时又可以激活MMP1、MMP8、MMP9的活性〔5〕，共同参与ECM的降解过程。MMP3 与能够激活的其他酶原形成一正反馈环，在MMP家族激活过程中具有关键作用。全面激活的MMPs可与自然存在的特异抑制剂TIMPs相互作用而被抑制。TIMP的抑制作用是通过其氨基酸功能区的半胱氨酸残基与活化MMPs的锌离子活性中心相结合而阻断MMPs与底物结合。已知的TIMP有4种(TIMP1、2、3、4),常由分泌MMPs的细胞按1∶1的比例同时分泌,激活的MMP的活性受特定TIMP的调节。TIMP1可以抑制MMP3、MMP1的活性，从而影响整个MMPs/TIMPs系统。

　　PAPPA是Zn2+依赖性蛋白酶超家族的新家族〔6〕，临床以往主要应用于妊娠早期对唐氏综合征，性染色体异常，18三体胎儿的产前筛查。近年来,研究显示PAPPA作为锌离子依赖性金属蛋白酶可降解ECM,在动脉粥样硬化斑块破裂及血管壁构型改变中起重要作用，同时还发现它是动脉粥样硬化介导因素之一——胰岛素样生长因子的一种特异性激活剂，并认为血清PAPPA可作为ACS新的标记物。BayesGenis 等〔7〕发现PAPPA在不稳定斑块细胞及ECM大量表达，而稳定斑块则没有;ACS患者循环中PAPPA水平显著升高，推测其可能是不稳定斑块新的标志物。随后Qin等〔8〕研究发现，在ACS患者和孕妇中的PAPPA的分子结构是不同的，在ACS 患者外周血中的PAPPA没有与proMBP亚基结合。国内研究也发现〔9～11〕，PAPPA在ACS患者的外周血中显著升高，与斑块的稳定性相关，有助于冠心病的危险分层，且可能是较早期(<6 h)的危险因子〔12〕，是ACS患者预后的独立危险因素〔13〕。

　　炎症在不稳定斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要作用〔14，15〕。急性冠脉事件与不稳定斑块破裂有关，炎症可能是一种重要的触发机制。尸检发现在不稳定或破裂的动脉粥样斑块内聚集着大量的泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞，其中巨噬细胞数目不稳定斑块是稳定斑块的4倍〔16〕;这些炎症细胞能够产生大量的炎性细胞因子，如白细胞介素1β、IL6、C反应蛋白等，在ACS患者的外周血中的水平显著升高，并与ACS患者的预后密切相关。本研究模拟不稳定斑块的局部炎症条件，应用炎症因子IL1β、IL6刺激人冠状动脉粥样硬化斑块末期主要泡沫细胞来源——人冠状动脉平滑肌细胞，结果提示炎症因子能够在转录水平上调平滑肌细胞中PAPPA、MMP3的表达，并有剂量和时间依赖效应，本结果同最近Conover等〔17〕对PAPPA的研究一致;能够解释临床研究中PAPPA水平和炎症因素显著相关的现象，以及病理研究中为何MMP3、PAPPA在炎症反应强烈的不稳定斑块和破裂斑块中大量表达，而在炎症反应少的稳定斑块中表达得很少。细胞因子对TIMP1的表达呈现的是抑制作用,这在ACS的发生中具有非常重要的作用，因为TIMP是MMP的天然抑制剂，具有稳定斑块的作用;炎症因子的促MMP表达及抑TIMP表达作用，放大了MMP对斑块外基质的降解作用，加速了不稳定斑块的形成。但临床研究外周血中的TIMP1水平是升高的〔9〕,其原因可能是炎症因子对平滑肌细胞中TIMP1表达的直接作用是抑制的，而在ACS患者中因为不稳定斑块的孕育时间较长，局部表达增高的MMP3代偿性上调了巨噬细胞及平滑肌细胞中TIMP1的表达，导致在斑块破裂时有大量的TIMP1释放入血。

　　本研究提示，炎症反应存在背景下，MMP高表达可能是其在动脉粥样硬化斑块发生发展、不稳定化及破裂过程中的作用机制之一。这为我们进一步研究炎症作用机制及临床应用抗炎治疗提供理论依据。但因本研究只是体外炎症反应细胞模型，不能够完全代表生理情况下体内复杂的炎症反应及其代偿机制的影响,尚需进一步研究。

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