扭曲基因在成釉细胞瘤中的表达及其意义

作者：郭华，周银梅，唐休发，华成舸，王斯华    作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；2.四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科 四川 成都 610041     【摘要】  目的 探讨扭曲基因（twist）在人成釉细胞瘤（AME）中的表达及其意义。方法 用免疫组化法检测40例AME标本和10例根尖囊肿标本中Twist的表达情况；用蛋白质印迹技术检测5例AME和1例根尖囊肿组织中Twist的表达情况，分析其临床病理意义。结果 Twist在AME和根尖囊肿组织中的阳性率分别为75.0%和20.0%，在AME中的表达明显高于根尖囊肿组织（P<0.05）；Twist在一般型AME中的表达水平明显高于单囊型（P<0.05）。与根尖囊肿组织相比较，Twist在AME中表达明显上调（P<0.05），但单囊型AME与根尖囊肿相比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 Twist在AME中高表达可能与AME的发生发展密切相关。

    【关键词】  成釉细胞瘤； 扭曲蛋白； 上皮-间质转化； 转录因子

    Expression and significance of twist gene in human ameloblastoma  GUO Hua1, ZHOU Yin-mei1, TANGXiu-fa2, HUA Cheng-ge2, WANG Si-hua1. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu610041, China; 2. Dept. of Head and Neck Tumor Surgery, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

    [Abstract]  Objective  To investigate the expression and clinicopathological significance of transcription factorTwist in human ameloblastoma（AME） and radicular cyst tissues. Methods  Immunohistochemistry was used todetect the expression of the Twist in 40 cases of ameloblastoma tissue and 10 cases of radicular cyst tissue. Meanwhile, the Twist protein were detected in 5 cases of ameloblastoma and 1 case of radicular cyst tissue by Western blot. And the expression differences and clinicopathological significances of the Twist were analyzed. Results  The positive expression rate of Twist in ameloblastoma tissues was 75.0%, which was significantly higher than that in radicular cyst tissues（20.0%, P<0.05）. Compared with in radicular cyst tissues, the protein expression of Twist were up-regulated in AME. Conclusion  Twist has an inappropriate expression in ameloblastoma and it may play an important role in the tumorigenesis and progression of AME.

    [Key words]  ameloblastoma； Twist； epithelial-mesenchymal transition； transcription factor

    成釉细胞瘤（ameloblastoma，AME）是最常见的颌骨牙源性良性肿瘤，因具有局部侵袭和术后易复发的生物学特点而被归为临界瘤。扭曲基因（twist）是一种在胚胎形态发生中起关键调控作用的转录因子，具有癌基因特性，能编码程序性细胞死亡抑制蛋白和介导上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[1-3]。twist在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤中均异常高表达[4-7]，其在口腔AME中的表达情况却未见报道。

    1  材料和方法

    1.1  标本来源

    免疫组化法检测标本均来自华西口腔医院病理科1998—2007年存档的石蜡块。在40例AME标本中，男18例，女22例；年龄11~65岁，中位年龄43岁；肿瘤大小3～6 cm。病理分型：滤泡型18例，丛状型14例，单囊型8例。此外，选取10例根尖囊肿标本作为对照组。 蛋白质印迹技术检测标本均来自华西口腔医院头颈肿瘤外科2007年2月至2007年9月间的手术切除组织，－70 ℃以下冻存。病理分型：滤泡型2例，丛状型2例，壁型1例，根尖囊肿1例。其中，男女各3例。

    1.2  主要试剂

    浓缩型鼠抗人Twist单克隆抗体（豪乙生物科技有限公司，中国），S-P试剂盒、DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

    1.3  免疫组化染色检测

    1.3.1  染色方法  所有标本均由质量分数10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片。每例常规行HE染色并由有经验的病理科医师复核诊断。免疫组化SP法染色。鼠抗人Twist单克隆抗体工作浓度为1∶400，4 ℃孵育过夜；DAB显色2～10 min。pH7.4的PBS液代替一抗作阴性对照。

    1.3.2  结果判定  Twist主要表达于肿瘤细胞的细胞质，以细胞质和（或）细胞核呈棕色或棕褐色为阳性，以细胞质和（或）细胞核无棕褐色或与背景色一致或极淡的棕色为阴性。于40倍显微镜下观察整张切片表达情况，选择表达最集中的5个视野并在高倍视野下计数阳性细胞，得出阳性细胞百分率，取平均值。参照文献[8]标准，按阳性细胞占总细胞数的比例分级：小于5%为“－”，5%～25%为“＋”，26%～50%为“＋＋”，大于50%为“＋＋＋”。

    1.4  蛋白质印迹技术检测

    去除细胞裂解液3次，提取肿瘤组织总蛋白并测定其质量浓度，调整各样本的总蛋白质量浓度为5.0 g/L。取20 μL总蛋白，用质量分数10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并将其转移至硝酸纤维素膜，取相对分子质量为4.30×104～4.75×104的片段进行检测。将Twist一抗稀释为1∶2 500，β-肌动蛋白稀释为1∶400，4 ℃孵育过夜。将辣根过氧化物酶标记的二抗（山羊抗小鼠，1∶5 000）于37 ℃孵育1 h，PBS-T洗膜（10 min×3次），电化学发光法显色。结果用灰度扫描比较法相对比。试验重复3次以获取统计学意义。

    1.5  统计学方法

    采用SPSS 10.0软件分析结果，对AME和根尖囊肿的比较用校正的卡方检验，而不同病理类型AME间的比较则用确切概率法。

    2  结果

    2.1  免疫组化结果

    2.1.1  Twist在人AME和根尖囊肿组织中的表达  Twist呈棕色或棕褐色，主要位于肿瘤细胞的细胞质，少数位于细胞核。Twist在AME组织中约75.0%（30/40）表达呈阳性，其中多数病例呈＋＋～＋＋＋表达，多数阳性肿瘤细胞弥散分布，少数阳性细胞聚集呈片状高表达（图1），有的肿瘤边缘呈局灶性强阳性表达（图2）；根尖囊肿组织基本不着色（图3），10例中只有2例呈弱阳性表达（图4）。两者差异有统计学意义（P<0.05）。

    2.1.2  Twist的表达与AME病理类型间的关系  Twist在滤泡型AME中阳性表达为88.9%（16/18），在丛状型AME中阳性表达为85.7%（12/14），在单囊型AME中阳性表达为25.0%（2/8）。3组间两两比较，Twist在前两型中表达无明显差异，而在后者明显弱于前两者，差异有统计学意义（P<0.05）。

    2.1.3  Twist在单囊型AME和根尖囊肿组织中的表达  Twist在单囊型AME中阳性表达为25.0%（2/8），在根尖囊肿中阳性表达为20.0%（2/10），两组比较差异无统计学意义（P＝0.896）。

    2.2  蛋白质印迹技术检测结果

    以β-肌动蛋白为内参照，结果显示：在滤泡型和丛状型AME中，Twist有较高表达；而在根尖囊肿和单囊型AME中，Twist蛋白几乎无表达。

    3  讨论

    研究证明，上皮钙黏着蛋白（epithelium-cad-herin，E-cd）与AME的局部浸润关系密切[9]。EMT系指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象，是一个失去上皮细胞极性、细胞接触能力下降，并重塑细胞骨架的过程。EMT是胚胎发育阶段的重要事件，参与胚胎发生、组织成形、慢性炎症和纤维化等过程，也可能参与了肿瘤的发生和发展[10]。E-cd的丢失是EMT最重要的特征之一。EMT致E-cd表达下调，降低细胞与细胞间的黏附能力，使得肿瘤细胞更容易从原发灶脱落向周围组织浸润[11]。当肿瘤细胞出现EMT时，可视为是肿瘤细胞浸润的开始[12]。

    Twist是一种存在于果蝇、鼠以及人等生物体内含碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，在胚胎发育中起关键调控作用[1]。Twist在胎盘、胚胎中胚层和某些中胚层来源的未分化组织中高表达。在胚胎发育的特定过程中，Twist能诱导细胞移动和组织塑型，而出生后降至低水平[13-14]。Vesuna等[15-16]发现，Twist既可直接与E-cd启动子区的E-box结合，从转录水平上抑制E-cd的表达，又可通过非转录调节使细胞黏着蛋白和纤连蛋白的表达增高来增加肿瘤细胞侵袭力。Yang等[17]在鼠的乳腺癌模型试验中应用RNA干扰技术沉默twist的表达后发现，乳腺癌细胞的增殖和存活力没有改变，但局部侵袭力明显降低，证实了twist主要是在肿瘤细胞从原位突破屏障侵入周围组织这一过程中起重要的调控作用。

    AME瘤细胞的增殖能力和局部侵袭能力与多种因素有关，比如Ki-67和人端粒酶反转录酶活性等[18-19]，Twist在AME中的作用尚无相关研究。AME主要分为一般型和单囊型，前者主要分为滤泡型和丛状型。本研究结果表明，Twist在滤泡型和丛状型AME中的表达水平无明显差异且两者的表达水平明显高于单囊型；而Twist在单囊型AME和根尖囊肿中表达水平无明显差异。这提示Twist在一般型AME中高表达，可能是一般型AME较单囊型AME有更高的局部破坏能力和预后相对较差的分子机制之一。因此，twist很可能是AME发生过程中的一个重要基因。由于肿瘤的发生发展受多因素影响，因此对于twist参与人成釉细胞瘤发生、发展、复发和预后的机制及其临床应用价值还有待更加深入的研究来证实。

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