Notch信号与牙胚发育和牙齿损伤

作者：修复马 亮综述 王胜朝，张亚庆审校    作者单位：第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科 陕西 西安 710032 【摘要】  Notch信号通路在进化上高度保守，它可以通过局部细胞间相互作用传导信号，调控细胞的增殖、分化、凋亡等多种生命过程，最终决定多细胞动物发育过程中多种细胞的命运。本文就Notch信号途径在牙胚发育以及牙髓、牙周损伤修复方面的作用作一综述。

【关键词】  Notch信号； 牙胚发育； 损伤修复

Progress on effects of Notch signal pathway in tooth germ development and dental repair after injury

    MA Liang, WANG Sheng-chao, ZHANG Ya-qing. （Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, School of Stoma-tology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China）

    [Abstract]  Notch signaling is a highly conserved mechanism throughout evolution. It controls cell proliferation, differentiation, apoptosis through interaction of cells, then determines the cell fate during multicellular development. In this review, the roles of Notch signaling involved in the tooth development and dental repair after injury were discussed.

    [Key words]  Notch signaling； tooth development； dental repair

    在牙胚发生发育过程中，众多信号分子和调控因子构成复杂的网络调控系统，这些信号通路相互作用共同诱导特定细胞的增殖、分化和凋亡，从而导致牙齿的发生。牙齿的发生发育受到上皮层与间充质相互作用的调控，其中存在许多信号传导通路的调控。各种信号分子如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等都在牙齿发生，形态形成以及细胞分化中扮演了重要角色[1]。而Notch信号通路是近几年关于牙胚发育生物学基因调控研究的热点。

    1  Notch信号通路对牙胚发育和牙齿形态发生的影响

    Notch信号通路在正常的牙齿发生过程中十分重要。牙齿是上皮层与间充质相互作用而形成的器官，二者相互作用使牙胚发育成具有多种细胞类型的复杂结构，其中包括上皮来源的成釉细胞和间充质来源的成牙本质细胞，它们合成并且分泌牙体硬组织的有机成分（前者形成牙釉质，

    后者形成牙本质）。在牙齿发育中，在相邻上皮与间充质细胞中可分别见到Delta与Notch分子的互补表达，且这种现象与成釉细胞和成牙本质细胞的分化有关。结果表明，牙齿发育中细胞的多样性是以Notch信号所介导的旁侧分化为基础的[2]。

    1.1  Notch受体与牙胚发育

    与牙齿发育相关的Notch受体主要有Notch1、2、3，且以前两者更重要。从蕾状期到帽状期（在胚胎第13.5天）位于牙胚顶端的蕾状期牙胚细胞停止分裂并形成一个上皮来源的信号中心，即釉结。釉结可在帽状期（E14即胚胎第14天）分泌生长因子和其他各种信号分子，且研究证实了釉结在调控牙齿形态发生中的核心作用。在牙胚发育早期，Notch1、2均表达于牙胚上皮来源的星网状细胞层中，但在周边基底上皮细胞层中不表达。在胚胎14 d，Notch1在所有星网状细胞中和整个釉结区都有表达，然而，Notch2仅在半数的星网状细胞中表达，且在釉结和颈环结构中表达微弱或不表达。牙胚发育阶段的一个重要特点是，Notch1、2在牙胚间充质细胞不表达[3]。而Harada等[4]认为，Notch1也可表达于中间层细胞，Notch2则高表达于星网状细胞和外釉上皮细胞。最近的一项研究表明，Notch1可在来自成人牙髓组织的SP（side population）细胞中表达，但是当SP细胞传代培养后，Notch1无法用反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测出来。其原因可能是它只在未分化的人牙髓细胞中一过性表达[5]。Mucchielli等[6]报道，在E13.5的小鼠切牙中，Notch2表达于切牙牙蕾上皮的唇侧和切牙沟的舌侧，Notch2的mRNA表达于上颌切牙牙胚上皮的前部，而在磨牙中则呈对称表达。接着，他们对Notch2在人乳牙牙胚发育中的时空表达作了进一步说明：1）在妊娠第6周，上皮牙蕾开始形成，此时Notch2表达于不与间充质相接触的牙胚上皮细胞，而不表达于牙蕾周围的间充质细胞；2）在帽状早期，牙胚上皮形成成釉器，间充质细胞形成牙乳头和牙囊。在此期，Notch2强烈表达于牙乳头和牙囊间充质细胞中；而在成釉器中，不与间充质细胞接触的上皮细胞不表达Notch2，其他的上皮细胞则有适度的表达；3）在帽状晚期，成釉器分化为内釉上皮、外釉上皮、星网状细胞和中间层细胞，Notch2表达于星网状细胞和中间层细胞，而在内外釉上皮层表达微弱；4）在钟状期，靠近牙胚上皮的牙髓细胞分化为成牙本质细胞并开始分泌牙本质基质，内釉上皮细胞分化为成釉细胞并开始分泌釉基质。此时，Notch2可以表达于成釉细胞、星网状细胞和中间层细胞，而在牙乳头中，Notch2不表达于成牙本质细胞。同时，Notch2在前成牙本质细胞层到成熟成牙本质细胞中呈梯度表达。研究还表明，虽然人与啮齿类动物牙齿发育中Notch2表达模式有相似之处，但在发育中的人牙胚上皮中，Notch2的表达模式与前期在啮齿类动物牙齿中的表达模式不同。Notch2在人乳牙的前成釉细胞和成釉细胞中表达，而在啮齿类动物牙齿中的这些细胞中未见表达[7]。

    1.2  Notch配体与牙胚发育

    在Notch配体中，与牙齿发育有关的主要有Jagged1、2和Delta1。Mustonen等[3]研究表明，牙胚在从蕾状期到帽状期过程中（E13~E14），Jagged1呈现高表达且表现出自身的发育调控模式，而Jagged2的表达较为微弱并且局限在上皮组织中。

    Jagged2转录产物在胚胎11 d时就已经在口腔上皮中出现，而Delta1在牙齿发育的这些阶段没有表达。Jagged1在星网状细胞中表达，其表型结构域与Notch受体重叠，且Jagged1在联系牙胚与口腔上皮的牙板细胞中呈现特异性高强度表达，在蕾状晚期（E13.5），它还一过性地表达于发育中的釉结。和Notch1、2一样，Jagged1同样不表达于基底层细胞。和notch基因不同的是，Jagged1可密集地表达于牙胚间充质细胞中。在蕾状早期（E13），Jagged1在牙胚间充质中广泛表达；在蕾状晚期（E13.5），它在最接近上皮牙蕾的间充质细胞中表达下调。另外，Harada等[4]报道，在小鼠和大鼠切牙的牙胚上皮细胞分化中，Jagged1可高表达于内釉上皮层和成釉细胞层。他们还发现，在成年啮齿类动物切牙根尖区的牙胚上皮中具有一个特殊结构，称为“根尖牙蕾”，从根尖牙蕾中成功培育出永生化牙胚上皮前体细胞系HAT-7。该细胞系可分化为不同的牙胚细胞。研究表明，在低密度细胞培养时，HAT-7细胞可同时低表达Notch1和Jagged1；当把细胞进行汇片融合后，分别表达这二者的细胞群出现分离，一群细胞高表达Notch1，而另一群则高表达Jagged1。另外还发现，重组Jagged1蛋白可以提高中间层细胞在HAT-7细胞系中的出现率，而这种效应可被Jagged1的抗体抵消。最近的研究表明，过表达Jagged1还可激活在出生后人牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）中的Notch信号通路。体外培养时，Jagged1可抑制DPSC向成牙本质细胞分化，表达Jagged1的DPSC不能在活体内形成矿化组织[8]。Mitsiadis等[9]报道，Jagged2也可在牙胚发育各个阶段表达。另外，Jagged2基因突变可对小鼠造成许多不良影响。首先，在Jagged2纯合突变鼠中，其上颌与下颌架相互融合，造成小鼠呼吸困难并使新生小鼠出现围生期死亡。其次，发育中的牙齿受到上颌与下颌架相互融合的影响，常表现为异常的牙尖和颈环结构。在Jagged2纯合突变的牙胚中，颈环变得较大且向下方的间充质突出，增生明显。这都表明，Jagged2所介导的Notch信号对于正常的牙齿发育有重要的作用。

    1.3  Notch信号靶分子与牙胚发育

    Mustonen等[3]报道，HES5基因在蕾状期和帽状期的牙胚上皮和间充质中均无表达，而HES1基因却表现为强烈表达，且大部分与Notch1、2共同表达于上皮细胞中。另外，在口腔上皮细胞和星网状细胞中HES1基因表达强烈，而在牙蕾基底层细胞中大部分呈阴性。在蕾状期和帽状期的釉结基本不表达HES1基因。在不表达Notch的间充质细胞当中，HES1和Jagged1却均有表达。

    HES1基因在蕾状早期、晚期以及帽状期中均高表达于凝聚的间充质中。最后，它限制性地表达于外周间充质中，而后者是形成牙囊组织的来源。研究证实，当牙胚间充质单独培养和与牙胚上皮共培养时，HES1基因可表达于部分间充质细胞中。这说明，HES1基因在上皮细胞中的表达需要来源于间充质的信号诱导。Harada等[4]研究发现，HES1的mRNA也可表达于中间层细胞。

    2  牙胚发育中调节因子对Notch信号的调控

    2.1  Lunatic fringe基因、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白的共调节体系Notch信号通路作为胚胎发育过程中重要的信号途径，其相关分子的表达、运输和降解受到诸多因素的调节[10]。其中与牙齿发育相关的主要是fringe基因，已知的3种fringe基因是Manic fringe、Radical fringe和Lunatic fringe，而只有Lunatic fringe基因在牙胚发育中起调控作用[3]。fringe所编码的氨基酸序列是Lex-1细菌家族糖基转移酶蛋白序列微弱的但很重要的同源序列，并且发现了fringe基因可影响Notch蛋白的糖基化。有研究表明，fringe基因可在高尔基体中选择性地使Notch受体胞外段EGF重复序列发生糖基化从而影响Notch受体与其配体的相互作用[11-13]。据Pouyet等[14]报道，Lunatic fringe基因在小鼠牙胚发育中的磨牙胚上皮和间充质均有表达，且Lunatic fringe基因在牙胚上皮中的表达与Notch受体表达表现出一种互补关系。当切牙上皮发生前后旋转时，Lunatic fringe基因在上皮中的表达呈不对称分布，且主要表达于切牙舌侧。而Mustonen等[3]则认为，Lunatic fringe基因只在牙胚上皮细胞表达，在口腔上皮和所有间充质组织均未见表达。他们还发现，在牙齿发育起始阶段的牙胚上皮未表达Lunatic fringe基因，并且在E13的牙蕾中其转录产物仍呈阴性表达。Lunatic fringe基因首次表达于蕾状晚期（E13.5）牙蕾舌侧的上皮细胞中。有趣的是，表达Lunatic fringe基因的细胞在发育中的釉结两侧出现。这在帽状期表现得更明显，此时Lunatic fringe基因在釉结颊侧表达并继而高浓度地表达于舌侧的颈环区。一部分Lunatic fringe基因表达于外釉上皮层，但大部分星网状细胞及整个釉结均未见其表达。Mustonen等[3]利用Whole-mount原位杂交对Lunatic fringe基因在三维层面上的表达进行的研究发现，此基因首先显著表达于釉结舌侧，继而从近中向远中沿着颊侧走行表达，最后在帽状期围绕釉结分布。这些差异，可能是标本取材时间和位置不同所造成的，但可明确的一点是，Lunatic fringe基因在牙胚发育中，尤其是牙胚组织边界形成中起到了重要的调控作用。另外，在体外牙胚上皮培养实验中，Mustonen等[3]还发现，重组的Lunatic fringe蛋白可分泌到细胞外发挥功能，并可通过诱导HES1的表达来激活Notch信号系统。在E13～14，HES1在牙胚舌侧所表达的mRNA水平要高于唇颊侧，表现在牙胚发育形态上，则会发现舌侧颈环比唇颊侧的发育要快。这都与舌侧有高水平表达的Lunatic fringe相一致。

    与此同时，还有一些其他影响因子对Lunatic fringe基因在牙胚发育中的表达有调控作用，它们主要有FGF、BMP家族。Harada等[15]报道，当将含有FGF-10的微载体加入培养中的颈环上皮组织中时，它们可刺激颈环上皮干细胞增殖，其起到的作用与Lunatic fringe基因一样。在成釉细胞分化的信号传导调控方面，FGF-10可激活基底上皮中Lunatic fringe基因的表达，而位于星网状细胞群中的牙胚干细胞表达Notch1受体，Lunatic fringe基因可调控Notch信号，当干细胞的子代细胞进入表达Lunatic fringe基因的基底上皮时，它可加入成釉细胞系并与间充质细胞相互作用。可见，来自间充质的FGF-10可通过激活Lunatic fringe基因表达来调节在牙胚上皮干细胞命运分化中的Notch信号通路。这一点也得到了Mustonen等[3]的证实。他们的实验证实，FGF-10主要表达于间充质，而FGF-4主要表达于上皮釉结中，当用吸附FGF-4或FGF-10的微载体培养E13的牙胚上皮时，Lunatic fringe基因则可在这些微载体的周围得以诱导表达。他们还发现，在E12～13时，含有BMP-2和BMP-4的微载体不诱导牙胚上皮中的Lunatic fringe基因表达；相反，在胚胎13 d的牙胚上皮中，含BMP-4的微载体却可抑制FGF-4和FGF-10对Lunatic fringe基因的诱导作用。而BMP-4微载体的这种抑制作用依赖于它的位置，当它位于FGF微载体附近时，抑制作用发挥完全；而在牙胚上皮组织培养物的对侧位置时，则不表现抑制作用，且在BMP-4微载体附近没有Lunatic fringe基因表达。唇颊侧间充质中的BMP-4可抑制此处FGF对Lunatic fringe基因的诱导作用，这最终使其仅表达于舌侧区域。在HES1表达调控上，他们还发现，HES1表达的上调至少依赖于两种不同的信号传导通路；一方面，Lunatic fringe基因可被FGF诱导激活并上调HES1；另一方面，HES1可不依赖Lunatic fringe而被FGF和BMP-4促进上调。意料之外的事实是，Lunatic fringe基因突变鼠并没有表现出明显的牙齿发育异常，且学者们特别关注的Manic fringe和Radical fringe都没有出现表达上调或误表达，所以，推测这其间有别的分子机制在调控釉结的边界形成，而究竟是什么机制目前尚未得知。

    2.2  转化生长因子-β的调控作用

    在牙齿形成中，转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1可激发成牙本质细胞分化和牙本质基质分泌[16]。Mitsiadis等[7]将可以释放TGF-β1的小管导入培养中的人牙厚切片的牙本质中观察发现，在远离TGF-β1的成牙本质细胞和前成牙本质细胞中有Notch2的表达，同时在牙髓血管中也有发现。Notch2的这种表达模式与在未添加TGF-β1的对照组中是相类似的。而在靠近TGF-β1的成牙本质细胞，前成牙本质细胞以及血管中Notch2不表达。在更远的位置如髓角，Notch2仅表达于前成牙本质细胞而不表达于成牙本质细胞。这意味着TGF-β1对Notch2在人牙髓中表达的影响呈剂量依赖性。

    3  Notch信号通路对牙髓和牙周损伤修复的影响

    3.1  Notch信号在牙髓损伤中的作用

    未分化的牙髓间充质细胞可分化成成牙本质细胞和牙髓成纤维细胞。成纤维细胞主要存在于冠髓并分泌形成牙髓细胞外基质。在成年啮齿类动物中，牙髓仍旧保持着损伤后的自我修复能力。当成牙本质细胞受损后，间充质细胞可分化成为新的成牙本质细胞，而后者则可形成修复性牙本质。牙齿发生过程中，Notch受体家族及其膜结合配体Delta/Serrate在决定细胞分化命运和发育模式两方面都起到了重要作用。而有关牙髓-牙本质复合体受到损伤时，Notch信号分子的表达调控作用以及其他相关因子的调节作用目前研究得还不是很充分。

    Harada等[15]认为，Notch1是牙源性组织干细胞的标志物。还有学者发现，Notch1在传代培养的人牙囊细胞中也可作为未分化细胞的标记物[17]。由此可见，Notch1主要作用于干细胞和前体细胞，从而对细胞自我更新和谱系分化发挥作用。这一点在牙髓损伤模型中同样有所体现。Mitsiadis等[18]报道，正常成年大鼠牙髓中未见到Notch受体表达，而在牙髓损伤模型中其表达上调。实验发现，Notch1仅在牙冠部近损伤区少数间充质细胞中微弱表达，另外在冠髓的血管样组织中还可见到模糊的Notch1染色。牙髓损伤时Notch2表达占主导地位，其在近损伤区的牙髓间充质细胞中呈强阳性表达，而在远离损伤区的冠髓组织中则呈弱表达。在损伤磨牙的修复过程中，Notch2可在尚未分化的牙髓细胞中得以激活，这些牙髓细胞将来会分化成为成牙本质细胞或牙髓成纤维细胞。这样，Notch信号的激活就可保证牙髓前体细胞持续不断地分化为成牙本质细胞。有趣的是，Notch2在远离损伤部位如根部（靠近根尖处）的牙髓组织中出现强阳性染色。这意味着根尖区存在着在牙髓损伤后能够再次分化为不同类型牙髓细胞的重要细胞群。Notch3的免疫反应主要表达于近损伤区间充质细胞，且在牙髓损伤时的牙根部，贯穿走行的血管组织中有一条Notch3强阳性染色带。对于Notch配体，在牙髓损伤组的成牙本质细胞中可检测出强阳性的Delta1杂交信号，另外在根尖区的成牙骨质细胞及牙骨质细胞中也可发现Delta1的强阳性表达。在牙髓损伤模型中，牙根部的Delta1表达与Notch2表达形成互补，后者仅表达在间充质细胞中而不在成牙本质细胞中。虽然Notch蛋白可在不同部位得以表达，但是只有当与表达Delta1的成牙本质细胞或成牙骨质细胞接触时，该通路才能激活。由此可见，Notch信号在由牙髓损伤引发的动态病理变化中起到了重要作用，Notch信号在牙髓损伤区的上调表达是牙髓组织自我修复的重要分子机制。Mitsiadis等[7]在进一步研究中明确指出，牙髓损伤后Notch2的表达占主导地位，具体表现为：1）Notch2在反应性牙本质形成区未见表达，但在损伤区远处有明显表达；2）Notch2在成牙本质细胞中未见表达，而在前成牙本质细胞中表达强烈；3）在牙髓血管组织中也发现了Notch2的表达。

    另外，他们还研究了在自然龋损状态下牙髓中Notch分子的表达情况。实验发现，Notch2表达于龋损区前方，具体表达于牙本质的细菌侵入层；在牙髓中，它表达于龋损下方的细胞和血管组织中；牙髓成纤维细胞不表达Notch2。随着龋损对牙髓激惹的加剧，变性退化的成牙本质细胞被新形成的成牙本质细胞所取代，这就是修复性牙本质。龋损下方分解破裂的成牙本质细胞和血管组织不表达Notch2，而在靠近血管组织的细胞中却有Notch2表达。在龋损区的成牙本质细胞中，Notch2的表达是与细胞凋亡有关的，而不是细胞分化。龋损区下方的成牙本质细胞因凋亡而被清除，而Notch2在龋损区下方成牙本质细胞中的表达，显示了其在病理状态牙齿的细胞凋亡过

    程中扮演了重要的角色。Lovschall等[19]利用氢氧化钙对成年大鼠上颌磨牙人工龋损模型进行盖髓术，发现术后第1天，Notch信号基因表达有所提高，而在第3天下降。Notch1在靠近损伤的个别前成牙本质细胞中表达升高。在被冠部成牙本质细胞包围的牙髓基质中，出现Notch2的增强表达。Notch1和Notch3在血管周围细胞中表达增强。另外，在牙髓损伤区附近有少量的Notch配体表达增加，其中Delta1表达于牙本质墙，而Jagged1表达于牙髓基质。作为Notch信号的下游靶基因，HES1沿着损伤区分布，并且靠近牙本质层。实验没有发现HES5的表达。这些结果说明，Notch信号在牙髓损伤时被激活，并与牙髓细胞分化为血管周围细胞和成牙本质细胞有关。这一发现与Notch通路可调控牙髓细胞再生过程中干细胞分化命运的推测是一致的。而Lovschall 等[20]进一步的研究发现，成人牙髓中含有一些具有干细胞特性的细胞群，而且Shi等[21]已经证明这些细胞来自毛细血管周细胞。Notch信号调控干细胞的分化，而G-蛋白信号通路调控子（regu-lator of G-protein signaling 5，Rgs5）是毛细血管周细胞的特异性标记物。小鼠牙齿在发育中和受损后的很短时间内，可检测到Rgs5和Notch3重叠表达。在受损牙髓的血管周围及个别毛细血管细胞中都可检测到这两种基因。然而，二者在牙髓损伤修复过程中的表达模式不同，Rgs5沿牙髓中央微动脉的血管外周平滑肌细胞呈广泛的分布。这些事实说明，这两种基因可在发育和受损牙髓中共表达，同时说明了血管来源的干细胞对牙髓损伤修复的重要性。

    3.2  Notch信号在牙周损伤中的作用

    Notch信号同样在牙周组织损伤的修复过程中起重要作用。Mitsiadis等[18]曾报道，在牙周损伤区，可检测到Notch1、2的表达，但没有检测到Notch3。另外，Notch1还可表达于一些牙槽骨的骨细胞中，在牙周膜的近损伤区可发现Notch2的强阳性表达，而Notch2在牙槽骨中基本不表达。这些都说明，损伤后的牙周组织可见到Notch信号的上调，这和损伤牙髓的情况类似。Notch2在牙周组织修复过程中起主要作用，并且主要表达于未分化细胞。

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