光活化消毒技术及其在根管内细菌灭活中的应用

作者：亓益品综述 凌均 审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院口腔医学研究所 广东 广州 510055

【摘要】  光活化消毒技术也称为光动力疗法、光动力抗微生物化学疗法，是在有氧条件下，应用光敏剂和低能量激光，实现微生物灭活的一种新技术。它具有抗菌谱广、可局部应用、对耐药菌株也可发挥作用等优点，为根管内感染控制提供了新的治疗手段。本文就光活化消毒的技术机制及其在杀灭根管内细菌中的应用作一综述。

【关键词】  光活化消毒； 光敏作用； 根管； 感染

APhoto-activated disinfection and its application in the treatment of root canal infection  QI Yi-pin, LING Jun-qi. （Research Institute of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou510055, China）

    [Abstract]  Photo-activated disinfection（PAD）, also known as photodynamic therapy or light-activated antimicro－bial chemo-therapy, involves the use of a photoactive dye（photosensitizer） that is activated by exposure to light of a specific wavelength in the presence of oxygen. It is endowed with several favorable features for the treatment of infection in root canals, including a broad spectrum of antibacterial effect, the localization of its action, and the efficient inactivation of antibiotic-resistant strains. PAD provides an alternative approach to controlling root canal infection. This review summarized the mechanism of PAD and researches on its application in the inactivation of root canal bacteria.

    [Key words]  photo-activated disinfection； photosensitization； root canal；  infection

    光活化消毒技术（photo-activated disinfection, PAD）又称光动力疗法、光动力抗微生物化学疗法，是一种新兴的抗微生物方法，包括光敏剂和光源的联合应用，在肿瘤治疗中的应用比较常见。光敏剂被激发后与氧分子反应，产生高活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），从而造成微生物体不可逆的损伤和坏死。光动力疗法作为一种辅助手段，已经在肿瘤、心血管、皮肤、眼部疾病治疗中得到应用。

    细菌在牙髓根尖周病的发生发展中起着关键的作用，感染根管内存在着复杂的细菌群落，包括球菌、杆菌、螺旋菌、丝状菌和真菌[1]等，常见的有中间普雷沃菌、微小消化链球菌、中间链球菌、具核梭杆菌、粪肠球菌等。根管治疗的主要目的是去除根管内病原菌，促进根尖周组织愈合。目前的治疗手段包括根管成形、根管冲洗、根管消毒以及最终的严密充填。但常规的根管预备、冲洗和消毒通常无法完全清除根管内的感染菌。其中治疗的最大困难存在于根管系统，尤其是磨牙根管形态的复杂性，使有些部位如根管峡部和交通支治疗器械无法到达，导致牙髓组织和细菌残留。此外，冲洗液（如NaClO）在感染根管内的渗透性十分有限，仅约130 μm，而微生物膜会侵入牙本质小管内达300 μm或更深处，有些甚至可达牙本质牙骨质界（深达1 000 μm）[2]。

    为此学者们积极探索了其他的根管消毒方法，如使用臭氧作为消毒剂，但其疗效并不稳定。另一种方法是使用高能量激光，因其杀菌机制为剂量依赖性热效应[3]，会造成牙本质熔融、牙根吸收、根尖周组织坏死等不良后果，因此需要一种新的消毒手段来控制根管内感染。

    1  光活化消毒技术的基本原理、要素和优点

    1.1  光活化消毒技术的基本原理

    PAD是一种冷光化学反应。在组织和活细胞外加入光敏剂后，光敏剂结合在胞膜表面并被吸收至胞内。光敏剂在未被激发时，有着稳定的电子构架，呈单体。此时光敏剂处于能量最低值，即基态，分子内没有未配对的电子。受到特定波长光源照射之后，光敏剂被激发，1个分子吸收

    1个光子。激发态（单态）的存在时间很短，半衰期仅为10-9～10-6 s，其后光敏剂可以发出荧光回到基态，或者转化为三态。单态的光敏剂可以和周围分子发生Ⅰ型反应，三态则可以发生Ⅱ型反应。前者通过氢原子或电子的转移，产生带有自由基或离子基的活性物质，由这些活性物质直接损伤细胞，或与氧反应产生ROS（如超氧化物或过氧化物），来攻击靶细胞。Ⅱ型反应中，能量从三态光敏剂直接转移至氧分子，生成ROS。ROS可以使细胞壁破裂、细胞器破坏、致病因子灭活甚至DNA损伤，并最终造成细胞死亡。Ⅰ型反应和Ⅱ型反应可同时发生。在此过程中，部分光敏剂未被消耗或破坏，可回到最初的基态，重复能量传递过程。

    1.2  光活化消毒技术的基本要素

    PAD的基本要素是光敏剂、光源和氧，三者共同作用下才能产生效果。理想的光敏剂要求无毒，只在被光照后体现局部毒性，且与哺乳动物细胞相比，对于微生物的杀伤应该有高度选择性，现阶段采用的光敏剂主要为各种染料，如亚甲基蓝（methylene blue，MB）、甲苯胺蓝O（toluidineblue O，TBO）、卟啉螯合物等。光源常采用功率小于500 mW、波长在630～700 nm的低能量激光，输出功率可被精确调控。研究结果普遍显示：单体氧在PAD中起主要作用，PAD的作用很大程度上依赖于氧的存在和局部浓度。

    1.3  光活化消毒技术技术的优点

    光活化消毒治疗，为控制口腔局部感染性疾病提供了比常规治疗方法更多的优点：1）可以局部使用，特别适合在口腔中应用；2）反应由自由基介导，可迅速杀死微生物而不产生耐药性；3）作用菌谱广，特别对于耐药菌株也有杀灭效果；4）无毒副作用；5）简便易用，设备的价格和治疗费用相对低廉。提示这是一种有潜力的控制口腔局部感染的治疗方法。

    2  光活化消毒技术在根管内感染控制中的应用

    2.1  体外实验

    早期对于PAD的研究[4-5]主要着眼于悬浮态细菌和单一微生物培养基，而忽略了根管形态和生物膜的复杂组成和生物行为。Wood等[6]使用PAD作用于体内形成的釉质表面生物膜后，观察到细菌生物膜变薄，结构也有显著变化，细菌胞浆空泡化和胞膜的损伤清晰可见。Soukos等[7]以亚甲基蓝为光敏剂，用665 nm的红光照射培养的悬浮态细菌，其中微小消化链球菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌均被灭活，而粪肠球菌则对治疗的反应较小，仅53%被杀灭。在离体根管内，即使应用了高质量浓度的亚甲基蓝和高强度的激光照射，人为培养的粪肠球菌生物膜也没有被完全消灭。分析其原因可能是高能量激光造成了局部低氧和牙本质小管微环境中氧分子的过快消耗，单体氧的生成受到限制，推测增加作用时间而非激光强度可能会实现粪肠球菌的完全灭活。Bergmans等[8]以635 nm、100 mW的激光和甲苯胺蓝O分别处理3种病原菌接种后的根管，发现93.8%的咽峡炎链球菌，88.4%的粪肠球菌以及98.5%的具核梭杆菌可被杀灭。同时使用环境扫描电子显微镜观察发现，PAD对单层细菌群落的破坏作用优于生物膜。原因是在生物膜中，TBO渗透深度受到限制，且表层细菌坏死之后，残余物可以形成保护层，覆盖并保护深层细菌。而生物膜中细菌生长速度较慢，也可能是使其比快速分裂增殖的细菌更具抵抗力的原因之一。但在具核梭杆菌和粪肠球菌混合培养的实验组中，细菌清除率却很高，推测可能此混合生物膜中有更多管道存在，有利于光敏剂渗入。Williams等[9]分别用4种方式（L-S-，L-S+，L+S-，L+S+，L为光源，S为光敏剂）作用于浮游态的常见根管内感染菌，发现只有L+S+组的细菌减少有统计学意义，而且杀菌作用因细菌种类而不同。在人造牙和天然牙中，接种细菌30 min后使用PAD，此时生物膜尚未形成，检测发现其抗菌作用较浮游状态下弱，说明根管形态和结构对PAD效果有一定影响。Seal等[10]的实验设计了不同质量浓度TBO（12.5～100 mg/L）与不同功率He-Ne激光光强（2.1～21 J）的组合共20组，研究对于接种于根管内48 h的中间链球菌的灭菌作用，发现最强者为TBO100 mg/L和光强21 J组。对比3%NaClO溶液冲洗发现PAD不能完全杀灭中间链球菌，效果逊于后者，分析可能与所用光源强度以及光纤头放置位置有关。此实验同时证实，TBO和激光单独应用都具有一定的杀菌作用。Garcez等[11]发现常规根管治疗与PAD共用对于根管内生物膜的去除作用比两者单用要强，两者共用后24 h细菌再生也最少，提示PAD可以作为根管治疗的一种有效辅助手段。

    粪肠球菌是兼性厌氧的革兰阳性球菌，在根管治疗失败的根管中检出率较高，被认为是顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌[12-13]，并且可耐受一般根管内常用药物。研究显示，单独应用100 mg/L的MB只能灭活20%的粪肠球菌，加用670 nm光照射后，灭活率也仅提高至40%[14]。与之相矛盾，Foschi等[15]用MB 6.25 mg/L和665 nm光源（60 J/cm2）作用于离体根管内培育3 d的粪肠球菌生物膜，检测显示78%的粪肠球菌可被消灭。有学者将PAD和0.5%NaClO溶液相对比，发现PAD可实现99.2%的粪肠球菌灭活，高于后者（93.25%）。不同研究者采用的细菌浓度、培育时间、研究方法、光敏剂和光源以及作用时间的不同，可能是导致粪肠球菌的灭活率存在差异的原因[16]。

    2.2  体内试验

    在临床研究方面，Bonsor等[17]研究发现PAD系统可杀灭传统根管疗法后依然存留的细菌。他们将患有不可复性牙髓炎和根尖周炎的64例患者分为两组，分别先后接受PAD和常规根管治疗，发现两者联合应用可以基本完全消除根管内的感染菌。单用PAD的细菌清除率也高于只进行传统的化学机械治疗方法，但两者在统计学上并无显著差异[18]。Garcez等[19]选取20例牙髓坏死及根尖周炎患者，对其感染根管进行了根管治疗合并PAD之后，发现PAD有助于减少根管内细菌量。

    3  光活化消毒技术的安全性

    将PAD推广至临床的关键之一，是确定其对除了细菌之外的组织是否有损伤和毒性。Foschi等[15]测量了接受光照10 min后的根管内温度，发现平均只比室温（22.5 ℃）高0.7 ℃。学者们将光源头置于离体牙工作长度，并将检测温度变化的热电偶紧贴根管外壁，测量发现：照射150 s后，温度上升值为（0.16±0.08） ℃，远低于根周组织损伤安全水平（7 ℃）。说明PAD不会对牙体和周围组织造成有害的热效应。此外，PAD对成纤维细胞和角质形成细胞的细胞毒性也远低于对致病微生物。而反应产生的活性氧可被根尖周的触酶迅速代谢，保护组织细胞不受损伤[20-21]。

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