4-1BB及其配体在口腔癌免疫治疗中的作用

作者：孙顺涛综述 杨宏宇审校    作者单位：北京大学深圳医院口腔颌面外科 广东 深圳 518036

【摘要】  4-1BB和4-1BB配体（4-1BBL）为肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体（TNF/TNFR）超家属的成员。研究发现，4-1BB和4-1BBL相互作用产生的共刺激信号在机体肿瘤免疫中起重要作用。本文通过对4-1BB/4-1BBL在共刺激作用的研究，探讨其在口腔癌免疫治疗中的潜在作用。

【关键词】  4-1BB/4-1BB配体； 共刺激分子； 免疫治疗

ARoles of 4-1BB and 4-1BB ligand in oral cancer immunotherapy  SUN Shun-tao, YANG Hong-yu. （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shenzhen Hospital, Peking University, Shenzhen 518036, China）

    [Abstract]  4-1BB and 4-1BB ligand（4-1BBL） are members of the tumor necrosis factor/tumor necrosis factorreceptor family, which are expressed on T cells and antigen-presenting cells（APC） respectively. In recent study, therapies utilizing the 4-1BB/4-1BBL signaling pathway have been shown to have antitumor effects in a number of model systems. In this report, we focus solely on the role of 4-1BB and its receptor 4-1BBL in costimulation and discuss its potential as a target for the immunotherapy of oral cancer.

    [Key words]  4-1BB/4-1BB ligand； costimulatory molecules； immunotherapy

    抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，尤其是活化的T细胞参与的免疫反应[1]。激活静止的T细胞需要两个信号：1）抗原呈递细胞（antigen present－ing cells，APC）呈递的抗原肽-主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）由特殊的T细胞抗原受体（T ell receptor，TCR）识别，并将信号传递给T细胞，此信号对T细胞的活化是必需的，但不引起T细胞增殖和分泌细胞因子；2）T细胞与抗原呈递细胞表面的共刺激分子相互作用产生第二信号[2]，共刺激信号对T细胞抗原特异性激活是必需的，缺少第二信号会导致T细胞无反应性，甚至凋亡[3-4]。介导共刺激信号的分子有多种，4-1BB与其配体（4-1BB ligand，4-1BBL）是其中非常重要的成员之一。4-1BB/4-1BBL介导的共刺激信号可以诱导T细胞活化、增殖及抗凋亡，是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的，有望为肿瘤生物治疗开拓新的途径。

    1  4-1BB分子及其配体的结构特性

    1989年，Kwon等[5]首先发现和报道了小鼠4-1BB基因。成熟的4-1BB蛋白含256个氨基酸，相对分子质量为30 000，主要由细胞外区、跨膜区和细胞浆内区组成，在胞膜外区有众多的糖基化位点，多以二硫键结合成相对分子质量为50 000的双体，也能以相对分子质量为30 000的单体形式存在。人的4-1BB又名诱导淋巴细胞活化（induced lymphocyte activation，ILA）和CD137。其cDNA是以小鼠的4-1BB DNA片段为探针在人外周血激活的T淋巴细胞cDNA文库中通过杂交分离获得，含有人4-1BB基因的全长编码区，基因定位于人1P36，与小鼠cDNA有60％的同源性，属肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族成员，为Ⅰ型跨膜蛋白，也由胞外区、跨膜区和胞浆内区组成，4-1BB蛋白分子可有两种形式，即膜结合型和可溶性形式的4-1BB，分别由相对分子质量为2 800和1 400 mRNA编码，但后者缺乏跨膜区。

    1993年，Goodwin等[6]克隆了小鼠4-1BBL基因。小鼠4-1BBL基因共编码309个氨基酸，相对分子质量为27 000。1994年，Alderson等[7]克隆并鉴定了人的4-1BBLcDNA。4-1BBL由255个氨基酸组成，为具有羧基端胞膜外区的跨膜蛋白，无潜在的N-连接糖基化位点，但在跨膜区附近有1个富含丝氨酸/脯氨酸的功能区可能包含有O-连接糖类[8]。它是Ⅱ型跨膜糖蛋白，也有膜结合型和可溶性两种形式，后者是由185个氨基酸组成的胞外段，两种形式均具生物学活性。4-1BB/4-1BBL在体内均以同源三聚体形式存在并发挥其生物学功能。

    2  4-1BB及其配体的表达

    4-1BB/4-1BBL的表达有一定的特点，受体呈诱导性表达，而其配体往往呈持续性表达。4-1BB主要表达于活化的CD4+T和CD8+T 细胞表面，在活化的NK细胞表面也可测得其表达。除此之外，4-1BB分子还能够诱导并且表达在部分肿瘤细胞上，活化的胸腺细胞、上皮细胞等非淋巴细胞、活化的NK细胞和嗜曙红细胞[7]也有表达。

    4-1BBL常表达于活化的抗原递呈细胞表面，包括巨噬细胞、B细胞和树突状细胞[6-7]，在受到cAMP、LPS或CD40L的刺激时表达上调，经CD3单抗处理后的T细胞刺激后30 min，可以检测到人4-1BBL表达[9]。近期发现，新分离的、未激活的人类自然杀伤（natural killer，NK）细胞表达几种肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族配体，包括4-1BBL[10]。4-1BBL除表达于活化的抗原递呈细胞表面，还可表达于某些病毒感染细胞以及肿瘤细胞表面。Seko等[11]用柯萨奇病毒B3诱导小鼠急性心肌炎，发现其心肌细胞表面可表达4-1BBL；此外，在急性心肌炎及充血性心肌病患者的心脏中亦有肿瘤坏死因子配体超家族，包括4-1BBL的表达。而Salih等[12]应用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白免疫印迹以及流式细胞术检测到4-1BBL可不同程度地表达于各种人类肿瘤细胞系以及来自患者的实体肿瘤细胞。4-1BBL在静止的APC表面的表达很低，被表面Ig 活化后表达升高。Salih等[13]报道静止白细胞可产生低水平可溶性4-1BBL（solubility 4-1BB ligand，s4-1BBL），细胞活化后s4-1BBL产生增多。此外，s4-1BBL在血液系统恶性肿瘤患者血清中水平明显高于正常人。

    3  4-1BB及其配体在免疫应答中的作用

    3.1  4-1BB及其配体在初级免疫应答中的作用

    4-1BB/4-1BBL是继CD28/B7之外的另外1对重要的共刺激分子，4-1BBL介导的协同刺激信号可导致CD4+T、CD8+T细胞的活化、增殖分化及细胞因子的产生。CD8+T细胞以4-1BBL依赖的方式产生白细胞介素（interleukin，IL）-2和干扰素（interferon，IFN）-γ；同样的条件下，CD4+T细胞产生IL-2和IL-4[14 ]。4-1BB-/-/4-1BBL-/-基因敲除鼠的模型的出现，使人们对4-1BB/4-1BBL在免疫应答中的作用的研究更加深入。研究显示，4-1BB-/-鼠中的T细胞在有丝分裂原和抗CD3的作用下促进增殖。然而，通过测定细胞因子的量和CTL的杀伤活性，显示4-1BB-/-鼠的T细胞免疫应答降低。4-1BBL-/-鼠的研究显示在初次应答的晚期病毒特异性T细胞有所减少。

    第一信号存在时，4-1BB/4-1BBL可使CD4＋T和CD8＋T细胞活化，研究显示，它可以使CD8＋T细胞优先扩增。通过4-1BB的受体传递的调节信号在CD8＋T细胞的细胞免疫应答中作用显著，同样，4-1BB在记忆性效应CD8＋T细胞的分化中发挥重要作用。4-1BB信号途径优先激活CD8＋T细胞。运用单抗选择性的体内敲除CD4＋T细胞，导致抗瘤效应的缺失，这说明在初始免疫应答中，CD4＋T细胞可能不是必需的，但是可能对于长期记忆性的应答的生成和维持是必须的。同样发现，CD4＋T细胞可以增强CD8＋T细胞的增殖和抗肿瘤杀伤作用。除了影响T细胞，4-1BB/4-1BBL还影响免疫系统的其他细胞。

    3.2  4-1BB及其配体在次级免疫应答中的作用

    关于4-1BB/4-1BBL在次级免疫应答的作用，多数病毒感染鼠模型的研究被报道。如用流感病毒X31免疫BALB/C鼠，3周后处死，取脾细胞

    分离，接着体外用H-2d标记的B淋巴瘤K46J细胞，表达4-1BBL和流感病毒肽刺激脾细胞。通过4-1BB受体的可溶形式体外再刺激阻断4-1BB/4-1BBL信号途径，可以部分消除次级CTL应答。用LCMV肽NP396-404免疫4-1BBL缺陷鼠或者野生型鼠，当给予竞争型α4-1BB单抗，4-1BBL缺陷鼠的CD8＋T细胞应答水平增加至与给予相同剂量的野生型鼠的应答水平相同。刺激后，野生小鼠仍有抗原特异性T细胞，对病毒感染有保护作用，这些说明，肽段疫苗能诱导长期的保护作用。然而-4-1BBL-/-鼠受到感染后无保护作用，说明4-1BB/4-1BBL信号途径在次级免疫应答的过程中意义重大。

    T细胞活化后，接着4-1BB开始表达，提示当CD28/B7信号缺失时，4-1BB/4-1BBL在免疫应答的后期发挥重要作用，然而，4-1BB/4-1BBL信号在淋巴细胞的增殖和存活中参与调节，在CD28存在和不存在时都能工作。当CD28缺失时，4-1BB分子能阻止AICD的发生，维持正在进行的免疫应答。

    3.3  4-1BB及其配体与CD28信号途径

    4-1BBL 所介导的共刺激信号与CD28/B7共刺激信号有协同作用，但两者在免疫应答的不同时期具有不同的作用优势。CD28表达于静止T 细胞表面，与其配体B7结合后产生共刺激信号，诱导T细胞活化并表达4-1BB，此表达于活化T 细胞表面的4-1BB与表达于活化APC表面的4-1BBL结合后所产生的共刺激信号，可维持并进一步加强CD28/B7产生的T细胞活化信号，从而抑制活化诱导的细胞死亡，并且维持CD28后期的免疫系统效能。由此可见，CD28对于T细胞增殖的早期是至关重要的，而4-1BB/4-1BBL信号则影响免疫应答中较晚期的T细胞数量且对记忆性CD8+T细胞群的存活和/或应答是必需的[15]。研究亦证实，CD28在T细胞增殖早期具有重要的作用，而4-1BB/4-1BBL则主要在维持CD4+和CD8+T细胞应答以及增强其细胞分化和效应T细胞功能方面起作用[14]。此外，4-1BB/4-1BBL可不依赖于CD28/B7而发挥信号传递功能。

    4  4-1BB及其配体与肿瘤免疫治疗

    肿瘤免疫治疗的目的是产生长期持久的、对肿瘤细胞特异性的CD8+T细胞。肿瘤细胞表面缺少4-1BBL等共刺激分子，被认为是肿瘤细胞逃避免疫监测的重要机制之一[16-17]。现阶段对4-1BB/4-1BBL在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在以下3个方面：过继性转移活体外协同刺激T细胞、抗-4-1BB单抗治疗和4-1BBL制造的全细胞疫苗。

    过继性转移活体外协同刺激T细胞是体外扩增、激活从荷瘤小鼠提取的T淋巴细胞，并将其重新输入荷瘤小鼠体内，以期达到杀伤肿瘤细胞的作用。Strome等[18]从广泛转移、低表达MHC-Ⅰ分子的黑色素瘤小鼠的引流淋巴结里分离出T淋巴细胞，经体外CD28和4-1BB途径激活后，输入另外1只黑色素瘤小鼠，结果显示，治愈率可达到60%。虽然在体外和动物模型获得令人鼓舞的结果，但是很难获得足够量的过继性转移T细胞移植入患者体内。而且CD8+T细胞经体外培养其功能会受到一定的改变。即使获得大量的功能性T细胞并输入患者体内，由于肿瘤逃避免疫监测的众多途径，过继性治疗难获得满意效果。

    抗-4-1BB单抗治疗是通过向宿主体内注入抗体，从而激活肿瘤特异性T细胞。其前提是肿瘤细胞低表达共刺激分子，注射抗-4-1BBL单克隆抗体使其与T细胞表面的4-1BB作用，激活肿瘤特异性T细胞，导致肿瘤细胞溶解。文献报道，应用4-1BB单抗可以消除已经建立的P815肿瘤实体瘤，对于弱肿瘤免疫原性的AG104A肉瘤也有明显的效果，这种抗肿瘤的效果具有完全治愈性，并对于下次肿瘤的攻击有记忆性，证明有长期的抗肿瘤的免疫反应存在[19]。

    实验中最常用的免疫治疗方法是将4-1BBL基因转入肿瘤细胞，使其在细胞表面表达，提高肿瘤细胞的免疫原性，Xiang[20]用含有4-1BBL的重组表达载体转化具有中度免疫原性的EL4肿瘤细胞系，将表达4-1BBL的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗，可诱导同源BalB/C小鼠EL4/4-1BBL肿瘤细胞系的消退且主要由CD8+T细胞介导并可进一步产生对EL4肿瘤的保护性免疫。Mogi等[21]研究发现NRS1作为一高表达共刺激分子CD80的小鼠鳞状细胞癌，却仍可在同源C3H小鼠中形成肿瘤；将4-1BBL基因导入NRS1细胞，则可有效诱发小鼠的抗肿瘤免疫应答，T细胞清除研究进一步证实CD8+T细胞是主要的效应细胞；结果表明转化的4-1BBL比自然表达的CD80对于初次抗肿瘤CD8+T细胞应答的产生更为有效。此外，CD80、CD86以及宿主来源的4-1BBL均参与了二次抗肿瘤应答。

    Guinn等[22]将B7-1、B7-2基因单独导入A20（B细胞淋巴瘤），不能赋予A20以完全的免疫原性，但是联合导入4-1BBL基因可使肿瘤具有高度的免疫原性并且在体内产生对亲代肿瘤的长期持久的保护性免疫。近期他们又发现CD28-/-小鼠可抵抗A20/4-1BBL转化子（导入4-1BBL基因的A20细胞系）而不形成肿瘤，而对于A20亲代细胞系则快速形成肿瘤。体外研究发现，A20/4-1BBL免疫的CD28+/+小鼠的脾细胞能够杀伤亲代肿瘤；而来自A20/4-1BBL免疫的CD28-/-小鼠的脾细胞对A20或A20/4-1BBL靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）杀伤活性则下降，而且其产生的IL-2、IFN-γ均少于CD28+/+小鼠。因此，无论CD28存在或者缺乏，4-1BBL均能够增强抗肿瘤应答，但CD28对于亲代肿瘤的保护性免疫却是必需的。

    Martinet等[23]用腺病毒介导的4-1BBL基因肿瘤内转化可使动物肝转移瘤明显消退；联合IL-12基因的瘤内转化可协同ADV/4-1BBL的作用，使动物的生存率达到约78%，证明联合IL-12等其他细胞因子和/或趋化因子用于肿瘤免疫治疗可产生协同效应。

    综上所述，对4-1BB/4-1BBL途径的体内外研究表明，4-1BB/4-1BBL在抗肿瘤方面是很有前途的靶标。更为重要的是，4-1BBL能够协同刺激CD28T细胞，导致细胞分裂、细胞因子的释放以及增加穿孔素水平和增强细胞毒性效应器功能[24]；并且4-1BB/4-BBL途径具有抑制记忆潜能，可能通过转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β依赖的机制，在介导肿瘤清除和抑制自身免疫疾病方面发挥双重作用，使得CD8+T细胞达到杀伤恶性细胞而不会因为过度刺激导致健康器官的自身免疫而损害这种相对平衡[25]，联合应用IL-12等细胞因子或B7等共刺激分子更能够有效地协同4-1BBL产生长期持久的特异性抗肿瘤免疫。4-1BBL在动物中的抗肿瘤效应是显著的，目前关于4-1BBL用于人类肿瘤治疗的报道甚少。进一步研究4-1BBL及其他共刺激分子有助于揭示肿瘤发生、发展的原因和规律，有助于为肿瘤的治疗提供更为有效的诊疗手段。

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