核心结合因子α1在正畸成骨中的作用

作者：何奇综述 陈丹鹏，潘劲松审校    作者单位：上海交通大学附属第一人民医院口腔科 上海 200080 【摘要】  核心结合因子α1（Cbfα1）是成骨细胞的发生和分化的特异转录因子，是骨形成的关键调控因子。在正畸治疗中，Cbfα1参与了牙移动过程中牙周组织的改建，在牙周膜细胞向成骨细胞转化及新骨形成中起重要作用。

【关键词】  核心结合因子α1； 牙周膜细胞； 正畸牙移动

    AThe role of core binding factor α1 in periodontal tissue during the orthodontic tooth movement  HE Qi,CHEN Dan-peng, PAN Jin-song. （Dept. of Stomatology, The First People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200080, China）

    [Abstract]  Core binding factor α1（Cbfα1） has been identified as a key regulator of osteoblast differentiation and bone formation, a osteoblast-specific transcription factor in osteoblast genesis and differentiation. Cbfα1 participates in the tissues remodeling during orthodontic tooth movement and plays an important role in the remodeling of pe-riodontal tissue．

    [Key words]  core binding factor α1； periodontal ligament cells； orthodontic tooth movement

    成骨细胞（osteoblast，OB）是骨形成过程中的重要功能细胞。核心结合因子α1（core bindingfactor α1，Cbfα1）是成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞分化和骨组织形成中起重要作用。牙槽骨改建是正畸牙齿移动中的主要生物学过程，牙周膜细胞在应力作用下的增殖、分化和移行在正畸牙周组织改建中起到重要作用，牙周膜细胞中包含具有成骨表型的细胞，在牵张力的作用下可向成骨样细胞分化。作为人牙周膜细胞接受力学信号刺激的目的基因，Cbfα1可调控成骨细胞在受到细胞外刺激后的分化过程。

    1  核心结合因子α1家族及结构

    1.1  核心结合因子α1家族

    Cbfα1又称为多瘤病毒增强子结合蛋白2A、急性髓性白血病因子3、Runt相关转录因子2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）和成骨细胞特异性因子2。Cbfα属于Runt结构域基因家族，其家族包括3个成员：Cbfα1、Cbfα2、Cbfα3。与果蝇的分节基因runt同源，与Runt蛋白相关的转录因子都有Runt结构域，它们通过Runt结构域能单独与DNA结合，但又可与广泛表达的Cbfβ配对形成异源二聚体；Cbfβ可与Cb-fα1形成异源二聚体阻止Cbfα1的泛素化水解，从而稳定Cbfα1，加强Cbfα蛋白与DNA结合的亲和力。

    1.2  核心结合因子α1的结构特征

    人的Cbfα1基因定位于6p21，Cbfα1基因由9个外显子组成，外显子1编码5′非翻译区，外显子2～9编码的多肽链存在4类功能区。其中转录激活区（activation domain，AD）分为3个部分，即AD1位于N端区域，由19个氨基酸组成；AD2位于Runt结构域的N端，由29个谷氨酰胺和18个丙氨酸组成；Cbfα1的C端因为富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸，也叫PST（proline serine threo nine）序列区域，含有1个激活域（AD3）和1个抑制域（repression domain，RD）。AD3位于PST结构域的N端，由27个氨基酸组成。核定位信号（nucl-ear localization signal，NLS）为位于Runt区域和PST区域分界处的9个氨基酸序列，负责Cbfα1的核输入；转录抑制区由羟基端的PST区域和尾部“VWPRY”基序组成，最后5个氨基酸（VWRPY框）被证实起转录阻遏作用。Cbfα1基因的多个外显子存在选择性剪接，产生多样Cbfα1的异构体，具有不同的转录激活潜能[1]。

    2  核心结合因子α1的成骨分化作用

    2.1  核心结合因子α1对成骨细胞的调控

    Cbfα1是成骨细胞分化的重要调控因子，是间充质细胞向成骨细胞分化的特异性转录因子。Ducy等[2]从3个方面阐述了Cbfα1的功能：1）DNA共转染实验显示Cbfα1可提高骨桥蛋白和骨钙蛋白启动子的活性；2）反义核酸实验发现成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达水平急剧下降；3）体外实验发现在非成骨细胞系中强制表达Cbfα1可诱导成骨细胞特异性基因的表达。研究证实，Cbfα1是成骨细胞分化必需的转录因子，在诱导成骨细胞分化的级联效应中发挥信号作用。成骨细胞在分化的过程中会陆续表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等表型标志物，逐渐形成细胞外基质。一旦基质成熟，成骨细胞被包埋其中形成骨组织[3]。Kojima等[4]通过移植带有Cbfα1基因的载体细胞诱导间充质干细胞向成骨细胞方向发展，发现Cbfα1亚体Til-1的超表达能够快速而强烈地诱导成骨细胞的分化。Ducy等[2]还发现，Cbfα1的超表达能诱导多潜能间充质干细胞C3H10T1/2向成骨细胞表型分化，并激活下游一系列成骨基因包括骨钙蛋白、Ⅰ型胶原等的转录；Cbfα1特异的DNA结合序列存在于骨钙蛋白启动子内，且于Ⅰ型胶原、骨桥蛋白等成骨细胞特异表达基因的启动子中均已发现。瞬时转染Cbfα1能明显上调Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白表达，而Cbfα1基因反义寡核苷酸则能阻止成骨细胞分化和骨化形成，从而揭示Cbfα1基因与成骨细胞发育、分化和骨组织形成过程密切相关。Ⅰ型胶原由两条链构成，由两个不同的基因编码，即α（Ⅰ）和α（Ⅱ）胶原基因。Kern等[5]通过电泳迁移技术分析证实，在α（Ⅰ）胶原启动子大约-1 347 bp处有OSE2序列，Cbfα1可以结合其上，调节Ⅰ型胶原基因的表达，而Kim等[6]证实了Cbfα1是成骨细胞特异的Ⅰ型胶原基因表达的正调节剂。Cbfα1还调节骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）的表达，其基因在成骨细胞分化过程中可被激活[7]。OPG是成骨细胞分泌的一种糖蛋白，是破骨细胞分化和骨组织吸收的有效抑制剂。Cbfα1也控制已分化的成骨细胞，如调控骨钙蛋白基因的表达。转基因小鼠实验也证实，Cbfα1可通过作用于已分化的成骨细胞，进而控制骨形成的速率[8]。所以，Cbfα1基因的表达在成骨细胞发育和分化以及骨钙化形成过程中起着极其重要的分子开关作用。

    2.2  核心结合因子α1对破骨细胞的调控

    研究发现，Cbfα1缺乏的小鼠破骨细胞骨吸收过程大大延迟，提出Cbfα1可能通过调节成骨细胞中核因子κB受体活化因子配体（receptor acti-vator of nuclear factor κB ligand，RANKL）和OPG的表达而影响破骨细胞的功能。通过基因敲除技术发现，Cbfα1杂合突变的小鼠牙齿发生过程中因破骨细胞数目减少而导致出牙延迟，说明Cbfα1在促进成骨分化的同时也参与了破骨细胞的生长和活性的调节，破骨细胞分化因子是成骨细胞介导破骨细胞分化和功能活动的重要调节因子[9-10]。小鼠RANKL启动子区亦存在Cbfα1的结合位点，因此Cbfα1可能直接调节RANKL的表达，从而调节破骨细胞的骨吸收功能[11]。

    3  影响核心结合因子α1功能的因子

    3.1  细胞因子对核心结合因子α1表达的调控

    Cbfα1的表达受到参与成骨细胞分化的多种生长因子的调控。报道较多的有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2等。BMP是成骨细胞分化和骨组织形成最有效的诱导因子，可以通过Smad途径上调Cbfα1的表达。TGF-β抑制Cbfα1表达和成骨细胞分化。TGF-β1和BMP-2通过Smad与P38、有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein ki-nase，MAPK）信号通路而在Cbfα1表达中发挥上调作用。FGF-2依赖蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）途径而发挥着促进Cbfα1表达和转录激活的作用[6]。Xiao等[12]发现，BMP-2对Cbfα1基因的转录没有影响，Cbfα1启动子区域缺乏BMP-2的应答元件，认为BMP-2只是以剂量依赖性的方式上调，可能Cbfα1参与了BMP-7级联放大效应。TGF-β是骨组织里的常在因子，体外培养发现它可抑制成骨细胞的分化。Alliston等[13]研究了TGF-β及其效应物Smad对于Cbfα1表达和功能的影响，TGF-β与细胞膜上的受体结合形成复合物，致使受体C末端丝氨酸上的Smad磷酸化，脱离复合物，进入细胞核内，与Cbfα1相互作用形成Cbfα1-Smad复合物，Cbfα1结合OSE2启动子特定序列的功能受到影响，而抑制了骨钙蛋白基因的表达。Gilbert等[14]研究了TNF-α对于Cbfα1表达的影响，并证实TNF-α对于Cbfα1 mRNA的表达有抑制作用，认为TNF-α引起Cbfα1剂量依赖性的抑制，主要是通过干扰mRNA和抑制转录而影响Cbfα1的表达，Cbfα1表达下调导致成骨细胞分化抑制，阻止骨形成。Xiao等[15]证实了

    FGF-2通过MAPK途径可以使Cbfα1磷酸化并激活，以时间和剂量依赖性方式刺激成骨细胞前体细胞骨钙蛋白mRNA和启动子活性。Cbfα1还可以通过自身启动子的负调控机制自动调控Cbfα1的表达及功能。在鼠的Cbfα1启动子区至少有3个Cbfα1识别位点，强制表达Cbfα1蛋白可以下调Cbfα1启动子活性。1个Cbfα1位点就足以抑制转录，这种自我调控严格控制Cbfα1的表达，从而可以调控骨相关基因的表达和成骨分化。

    Cbfα1通过由Smurf1（Smad ubiquitin regulatory factor 1）介导的泛素-蛋白水解酶复合体途径降解[16]。

    3.2  激素对核心结合因子α1表达的影响

    某些激素如糖皮质激素地塞米松、17β-雌二醇和1,25（OH）2D3等，对于成骨细胞生长和分化因子的表达有明显的影响，在骨的发育和组织钙化过程中起着重要的调节作用。Prince等[7]实验证实，地塞米松可以增强Cbfα1蛋白与DNA的结合能力，但对于Cbfα1 mRNA似乎没有作用，糖皮质激素对于Cbfα1的调节可出现在成骨细胞分化成熟的任何时期。1,25（OH）2D3通过激活或者抑制大量的骨表型基因而调节成骨细胞的分化。基因转染技术数据显示在1,25（OH）2D3作用过的MC3T3和ROS17/2.8细胞系Cbfα1的表达下调了，凝胶迁移率技术分析发现主要由于在Cbfα1近端启动子序列有功能性1,25（OH）2D3应答元件可以结合1,25（OH）2D3受体所致[17]。

    4  在正畸过程中核心结合因子α1对牙槽骨改建的作用

    Ziros等[18]证实了Cbfα1是牙周膜成骨细胞受到的机械刺激的重要目标，Cbfα1的mRNA和蛋白质水平还有DNA结合活性在受到机械应力后都明显升高了，显示牙周膜细胞受力向成骨细胞分化。此外，实验显示MAPK途径可以在活体中激动Cbfα1基因，Cbfα1蛋白是这些细胞的机械刺激的关键目标[19]。机械应力可以通过激活MAPK信号途径使Cbfα1磷酸化，从而调节成骨细胞的增殖、分化和骨形成[20]。同时，Xiao等[21]发现机械应力也可以通过ERK信号途径来调节Cbfα1的表达，从而控制牙周膜内成骨细胞样细胞的分化。Kawarizadeh等[22]通过高分辨率力/转矩传感器在大鼠磨牙上施加正畸力8 h后，发现牙周膜中pERK1/2阳性和Cbfα1阳性的细胞有显著的联系，在相同时间间隔发现pERK1/2阳性的细胞和Cbfα1阳性的细胞的比例相同，这种比例在张力作用下增加，说明牙周膜细胞向成骨细胞分化通过ERK途径。此外，在应力作用下，还观察到pERK1/2阳性和Cbfα1阳性的细胞的增加是以时间依赖性方式，说明了牙周膜细胞是延长机械应力后成骨细胞的来源。人牙周膜细胞的机械应力增强了MAPK的快速激动，结合到Cbfα1启动子的OSE2元件上使基因表达得到增强，除MAPK之外的其他因子也参与到应力诱导的Cbfα1表达的上调和激动，主要的激动蛋白（activator protein，AP）-1成分和早期的基因产物，c-Jun和e-Fos，在人牙周膜细胞受到机械应力后迅速上调，而MAPK抑制物的出现抵消了这种诱导效果。杨瑛等[23]通过实验建立大鼠正畸牙移动模型，在体内进行牙周组织施加正畸力的实验，结果显示，在施加正畸力后，尤其在牙移动相对较快的时期，牙周膜内Cbfα1表达明显增多。在施加机械应力后，Cbfα1 mRNA的表达在0.5 h后明显增加并在以后持续升高。时函等[24]实验显示，正畸牙移动初期，在机械力刺激下，张力区牙周膜内的成骨细胞特殊转录因子Cbfα1表达明显增加，促进了牙周膜中未分化间充质细胞向成骨细胞转化，引起牙周膜内细胞产生变化，成纤维细胞、成骨细胞增殖活跃；随着细胞增殖与成骨的活跃，牙槽骨表面的Cbfα1表达也增强，进一步证实了骨的形成是在牙周膜受到张力之后开始的。在实验组的牙周组织中，可以观察到不管在张力侧还是压力侧，Cbfα1的表达明显增强，且表达的分布与骨改建的活跃区域一致，且与正畸加力时间有关。吕琦等[25]发现，在牙周膜的压力侧，Cbfα1表达也增强，但较张力侧慢，表达的强度也较低；这可能与破骨细胞对矫治力的反应不如成骨细胞快速而敏感，以及破骨细胞的形成、活化、骨吸收作用是由成骨细胞和间充质细胞所介导的有关。免疫组织化学研究发现，压力侧牙槽骨表面出现虫噬状骨吸收陷窝和多核破骨细胞的同时还存在着蓝色的骨新生线，提示随着加力时间的延续，在压力侧骨吸收的同时伴有局部的骨新生，在高倍镜下还可观察到破骨细胞深染。最终，在Cbfα1的作用下，压力区成骨开始活跃，破骨受到抑制从而完成了骨改建。由于Cbfα1对骨代谢中相关细胞的调节是以自分泌或旁分泌形式进行，并存在负反馈调节机制，所以，当牙周膜中Cbfα1达到一定浓度后，其通过对本身启动子的负反馈实现部分自我调控，由此控制骨形成过程中Cbfα1基因的表达和功能[26]。同时，在成骨功能活跃阶段，成骨细胞和骨髓腔内新生类骨质出现Cbfα1染色强阳性，进一步证实了Cbfα1与骨改建密切相关[27]。随着新骨的逐渐成熟，Cbfα1被逐渐埋于基质中，这也导致正畸牙移动进入缓慢移动期后牙周膜染色逐渐减弱。随着加力时间的延长，牙齿移动，力值衰减，成骨细胞分化及新骨形成都趋于稳定，Cbfα1的表达强度也随之下降，并最终完成牙移动。

    综上所述，Cbfα1在正畸成骨过程中，在促进成骨细胞分化、加速牙槽骨改建过程中发挥着重要作用，研究多种刺激因素和局部因子条件下Cbfα1和牙周膜细胞在应力作用下的生物学特性，寻求有效利用Cbfα1来促进成骨细胞分化、加速牙槽骨改建过程的方法和使牙周膜细胞行使功能的最佳力学条件，对于了解其在正畸牙槽骨改建的过程中的作用机制有重要意义，还可以为临床上优化矫治力提供量化依据，使正畸后牙齿达到最佳稳定效果。

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