MIF促进新生微血管生成及其相关基因表达的研究

　　作者：蔡施霞，余细勇，林秋雄 ，单志新 作者单位：1. 广东医学院附属医院ICU，广东 湛江 524001　2. 广东省人民医院医学研究中心、广东省心血管病研究所，广东 广州 510080

　　【摘要】 目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)对新生微血管生成及血管内皮生长因子(VEGF)、 Smad1基因表达的影响。方法 以体外培养的人血管内皮细胞株EA.hy926为研究对象,分别用体外血管生成分析试剂盒及免疫组织化学染色法观察MIF在体内外对新生微血管生成的作用。通过基因芯片实验检测MIF对内皮细胞血管生成相关基因表达的影响，并通过RTPCR检测MIF对VEGF165、Smad1基因表达的影响。结果 MIF可以促进人血管内皮细胞在体外形成血管腔，在小鼠体内也能促进新生微血管生成。MIF可以显著上调血管内皮细胞血管生成基因21个，其中上调VEGF165、Smad1基因表达呈剂量依赖性。结论 MIF有促进新生微血管生成的作用，并能促进人血管内皮细胞中VEGF165、Smad1基因表达。

　　【关键词】 巨噬细胞移动抑制因子,新生微血管生成,血管生成相关基因

　　Abstract：Objective To investigate the roles of macrophage migration inhibitory factor(MIF) in neovascularization in vitro and in vivo and the roles of MIF in VEGF165, mothers against DPP homolog 1(smad1) genes expression in endothelial cells. Methods Angiogenesis assay in vitro by MIF, a numerical value was associated with a degree of angiogenesis progression. Angiogenesis assay in vivo by MIF, the factorⅧ immunohistochemical staining was used to assay the micro vessels density. Angiogenesis gene array by using the super array gene chip. Semiquantitative detecting the gene expression of VEGF and smad1 by RTPCR. Results MIF stimulated the tube formation of endothelial cells in vitro, MIF promoted the blood vessels formation in matrigel plug in vivo. MIF upregulated the mRNA expression of 21 angiogenesis genes，and upregulate the mRNA expression of the VEGF and smad1 in dosedependent way from 10 ng/ml to 50 ng/ml concentration. Conclusions MIF could promote neovascularization and upregulate the mRNA expressions of VEGF, smad1 in dosedependent way.

　　Key words： Macrophage migration inhibitory factor; Neovascularization; Angiogenesis genes

　　巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作为一种促炎症因子在免疫及炎症反应中起重要作用，在斑块形成和进一步损伤过程中亦发挥重要作用 [1]。MIF能显著提高肿瘤生长及与之关联的血管的发生[2]。由于血管生成与粥样硬化斑块的不稳定性有关[3]，为了推测MIF是否可能通过促进血管生成影响斑块的稳定性，采用体外培养的人血管内皮细胞株为研究对象，观察MIF对新生微血管形成的作用。内皮细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)是唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，在新生血管的形成过程中具有重要的作用。Smad1(mothers against DPP homolog 1)与血管生成和重构及保持血管完整性作用有关，还可以从转录水平调节VEGF的基因表达参与血管生成。本研究主要观察MIF对VEGF165、 Smad1的基因表达的影响，初步推断MIF促进新生血管生成的分子机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　细胞株: 人血管内皮细胞株(EA.hy926)由广东省人民医院医学研究中心保存。实验动物：BALB/c小鼠购自岭南实验动物中心，雄性，体重(25±3)g。试剂：重组人MIF(R&D)，体外血管生成分析试剂盒(CHEMICON)，BD Matrigel Basement Membrane Matrix (Becton Dickson)，第Ⅷ因子相关抗原(vWF)相应抗体(福州迈新)，Trizol Reagent kit、 ThermoScriptTM RTPCR system (Invitrogen )，PCR引物由上海生工生物技术公司合成。仪器：CO2培养箱(Queen)，3K30低温台式离心机(Sigma)，数码凝胶成像系统(BioRad)。

　　1.2 MIF促进新生微血管生成的体外实验

　　EA.hy926为贴壁生长细胞，培养用含100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素及10%胎牛血清的DMEM/F12，取传代的前3～5代用于实验。将 ECMatrix胶冻融稀释后以50 μl/孔铺96孔板，37℃放置1 h使胶凝固。将150 μl密度1×104/ml的内皮细胞铺在凝胶上，随机分成5组，每组4个平行孔，分别用2 ng/ml BSA ，2 ng/ml VEGF，25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml MIF处理细胞10 h，根据试剂盒说明书的评分标准评分，评分越高表明体外促进血管管腔形成的能力越强。

　　1.3 MIF促进新生微血管生成的体内实验

　　将10只BALB/c小鼠随机分成2组，于4℃将0.5 ml的基底膜提取物(Matrigel)与62.5 u的肝素，以及与PBS或终浓度为50 ng/ml MIF混合后，注射入两组小鼠腹白线皮下，注射后Matrigel在皮下迅速聚合成单一的固体胶，10 d后剥离出胶块，经固定，包埋，切片，用免疫组织化学染色的方法检测VWF观察血管生成情况，计算微血管密度。

　　1.4 MIF对内皮细胞血管生成相关基因表达影响

　　将内皮细胞接种于6孔板，随机分成2组，待细胞长至80%融合时，饥饿培养24 h，加入50 ng/ml浓度的MIF(空白对照组不加)孵育6 h后,采用Trizol一步法提取内皮细胞总RNA，送康成生物公司行SuperArray基因芯片实验检测血管生成相关基因表达水平。

　　1.5 MIF对VEGF165、Smad1基因表达的影响

　　将内皮细胞培养于六孔板，随机分成4组，每组3个平行孔，待细胞长至80%融合时，饥饿培养24 h后，每组分别加入终浓度为0，10，25，50 ng/ml MIF孵育6 h，提取细胞总RNA后逆转录合成模板cDNA。引物序列GAPDH：5′TCC ATG ACA ACT TTG GTA TCG T3′, 3′GTG GGC CAT GAG GTC CAC5′(500 bp);VEGF：5′ATG AAC TTT CTG CTG TCT TG3′, 3′TCA CCG CCT CGG CTT GTC A5′(578 bp);Smad1:5′TTT TGG TTC CAA GCA GAA GG3′, 5′TTG GGT TGC TGG AAA GAA TC3′(204 bp)。PCR反应条件GAPDH：58℃退火30 s，延伸60 s， 30个循环;VEGF：58℃退火40 s，延伸90 s，30个循环;Smad1：58℃退火50 s，延伸50 s， 45个循环。取产物各10 μl在1%琼脂糖凝胶上电泳后，经紫外图像分析仪扫描分析，目标基因与GAPDH条带吸光密度D(λ)比值代表目标基因相对表达含量。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS10.0统计软件，单因素方差分析，多组资料间比较采用q检验，两组资料间比较采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MIF促进新生微血管生成的体外实验

　　阴性对照组(BSA组)内皮细胞散在分布，未聚集成管腔结构,而阳性对照组(VEGF组)和不同浓度MIF处理组，内皮细胞能聚集成明显的管腔结构。量化分析显示与阴性对照组比较,25～100 ng/ml浓度的MIF组随着浓度递增,评分逐渐增加，BSA组为0.917±0.319，VEGF组为2.667±0.272，MIF 25 ng/ml组为2.333±0.272，MIF 50 ng/ml组为3.000±0.272，MIF 100 ng/ml组为4.250±0.319，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 MIF促进新生微血管生成的体内实验

　　10 d后取出皮下注射的matrigel plug，肉眼观察发现50 ng/ml MIF组的matrigel plug出现明显血管丛，类似血管瘤样物，而对照组的matrigel plug只发现少许发丝样血管。第Ⅷ因子相关抗原(vWF)免疫组织化学染色后,发现对照组迁移入的内皮细胞散在，几乎无血管形成，而MIF组可以见到典型的血管结构，并计算微血管密度，结果发现50 ng/ml MIF组的血管数量(6.067±1.581)明显多于阴性对照组(0.333±0.236),两者差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 MIF对内皮细胞血管生成相关基因的影响

　　与对照组比较，50ng/ml MIF刺激组的血管生成基因表达上调的基因有34个，其中上调10倍以上的基因有21个，分别为CGA, TKR1/Her2, FGF1, FGFR3, VEGFD/F,GROa/MGSA,Heparanases,IL12A,IL8,Angiomotin,Smad1,MMP9,PDGFa,PDGF2/SIS,PRL,Cox1,Cox2,TGFα,TGFb3,TNFA,VEGF。

　　2.4 MIF对VEGF165、Smad1基因表达的影响

　　通过RTPCR法证实在刺激时间为6 h时，与对照组比较，MIF可以上调内皮细胞VEGF165、Smad1的mRNA表达，且呈剂量依赖性，即随着MIF浓度从10、25、50 ng/ml增加 ，VEGF165、Smad1的mRNA表达递增(表1)，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。表1 RTPCR分析基因VEGF165、Smad1的相对表达量(略)注： 与空白对照组比较 aP<0.05;与MIF 10 ng/ml组比较 bP<0.05; 与MIF 25 ng/ml组比较 cP<0.0

　　3讨论

　　动脉粥样硬化病灶主要涉及血管内皮细胞和中膜平滑肌细胞，在炎症和损伤的刺激下能产生MIF影响斑块的稳定性。人体内分泌MIF的主要是单核及内皮细胞，其分泌MIF的量和浓度与斑块的进展密切相关。近来研究发现不稳定斑块内富于新生的微血管，可能是导致斑块破裂的核心事件[4]。血管新生是指原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重构等过程产生新的血管的过程。血管内皮细胞形成小管样结构是新生血管的必然过程，在体外，MIF可以诱导人皮肤微血管内皮细胞在Matrigel中的细胞移动和管腔形成。在体内，可以诱导Matrigel plugs和角膜生物测定中的血管生成。本研究首次证实了MIF能在体外促进血管内皮细胞形成血管管腔样结构，在小鼠体内也可以诱导Matrigel plugs中新生微血管的生成，即MIF有促进新生微血管生成的作用。

　　在胆固醇兔模型上证实VEGF165能增加兔胸主动脉粥样硬化斑块的发生率和程度，直接证实了血管生成在动脉粥样硬化斑块形成和发展中的作用。MIF可以促进巨噬细胞活化并产生VEGF，导致内膜新生血管的形成。MIF可以促进肿瘤细胞的浸润及促血管生成因子的表达,例如在肝细胞癌中发现，MIF能上调VEGF、 IL8基因表达水平，并具有明显的剂量依赖性。我们通过Super Array基因芯片检测发现50 ng/ml MIF刺激内皮细胞后能上调血管生成相关基因表达水平，其中有21个基因上调明显，其中包括了VEGF165、Smad1、 IL8等基因。为进一步了解MIF对VEGF165和Smad1基因表达的影响，我们通过RTPCR法发现MIF在10～50 ng/ml时上调VEGF165和Smad1基因表达的作用呈剂量依赖性。

　　MIF可以通过RasMAPK和RasAkt/PI3K信号通路促进肿瘤细胞生长及血管生成。我们通过基因芯片检测发现MIF能明显上调Smad1基因表达水平，提示MIF可能通过Smad信号转导途径促进新生微血管生成。

　　在此研究基础上，我们将进一步通过动脉硬化动物模型来研究MIF对动脉硬化斑块内的血管生成和稳定性的影响及其作用机制，为治疗不稳定斑块找到新的靶点。