牙周可疑致病菌代谢组学鉴定的初步研究

　　作者：鲁维希 吴亚菲 肖丽英 李明云 郭强 熊萍 贾向明 肖晓蓉 朱硃 龚其美 李伟    作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；2.四川大学 分析测试中心，四川 成都 610041

　　【摘要】目的 分析比较牙周可疑致病菌的核磁共振代谢图谱，探讨用代谢组学方法快速鉴定口腔细菌的可能性。方法 分别在BHI液体培养基中接种相同密度的牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌，采用比浊法绘制生长曲线。取3种细菌生长稳定期的培养液进行核磁共振氢谱（1H-NMR）测定，用主成分分析法进行数据分析。结果主成分分析显示3组数据各自有较为集中的类聚关系，可以区分这3种细菌。结论 代谢组学是一种具有良好应用前景的口腔细菌分类鉴定方法。

　　【关键词】  代谢组学 核磁共振 细菌 鉴定

　　Preliminary study on the discrimination of putative periodontal pathogens with a metabonomics method  LU Wei-xi1, WU Ya-fei1, XIAO Li-ying1, LI Ming-yun1, GUO Qiang1, XIONG Ping1, JIA Xiang-ming2, XIAO Xiao-rong1, ZHU Zhu1, GONG Qi-mei1, LI Wei1. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Analytical and Testing Center, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

　　[Abstract]  Objective  To evaluate the feasibility of identifying oral pathogenic bacteria by comparing the metabolicprofiling of putative periodontal pathogens and try to find a convenient and rapid way to discriminate oral microor-ganisms. Methods  Suspensions of Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Fusobacterium nucleatum withsame density were prepared and cultured respectively at liquid BHI medium. Then the growth quantity was measuredperiodically through turbidimetry and the growth curves of the inoculated bacteria were completed. The culture solutionsof stable growth phase were sampled and characterized by 1H-nuclear magnetic resonance（1H-NMR）. The data of 1H-NMR spectroscope results were analyzed by principal components analysis（PCA）. Results  The PCA showed the obviousclustering phenomena and the points of three groups differentially centralized to three clusters. Therefore, the NMR-based metabonomics profiles could discriminate the three different kinds of bacteria. Conclusion  The metabonomicsis a potential classable method to identify the oral pathogenic bacteria.

　　[Key words] metabonomics； nuclear magnetic resonance； bacterium； identification

　　牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、中间普氏菌（Prevotella intermedia，P.intermedia）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）是牙周疾病重要的致病菌，其快速有效的鉴别对病因的研究及疾病的治疗十分重要。现有的细菌鉴定方法在快速、准确方面都有不尽人意的地方。代谢组学（metabonomics）是一门对某一生物或细胞所有低相对分子质量代谢产物进行定性和定量分析的学科[1]，具有整体动态、无偏向性、研究技术多样、实验方法灵活等特点。代谢组学揭示的是系列关联生物标记物的综合差异，因此比传统依赖单一标志物的细菌鉴别方法具有更高的准确性[2]。本实验用核磁共振氢谱测定（1H-nuclear magneticresonance，1H-NMR）的代谢组学方法对3种牙周可疑致病菌的代谢图谱进行分析比较，研究其胞外代谢产物的差异，探寻一种快速、准确、全面的微生物分类鉴定方法。同时，探讨用该方法寻找牙周可疑致病菌代谢产物特异性生物标记物的可能性。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验菌株、实验仪器及实验试剂

　　牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277、中间普氏菌ATCC 25611、具核梭杆菌ATCC 25586（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供）。CH-2生物显微镜（Olympus公司，日本），比浊仪（Nephelomter公司，美国），MR1812高速低温离心机（Jouan公司，法国），DRX600核磁共振仪（BrukerBiospin Rhein-stetten公司，德国），重水D2O（购自上海楚柏实验室设备有限公司）。

　　1.2  生长曲线的绘制

　　将经过48 h复苏，48 h传代的牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌经显微镜形态学检查及生化鉴定为纯培养后，接种于BHI液体培养基中，专性厌氧培养48 h，并用比浊仪调整菌悬液密度为3×108 CFU/mL备用。在8支试管中各加入BHI液体培养基3 mL，每支加入密度为3×108 CFU/mL的菌悬液100 μL。将试管置于37 ℃，80％N2、10％H2、10％CO2的专性厌氧环境中培养，在8、12、16、20、24、28、40、52 h时间点各取出1支用比浊仪测定密度，3种细菌按同法处理。重复实验3次，取每个时间点的平均值，以时间（h）为横坐标，菌落形成单位数（CFU/mL）的对数值（log）为纵坐标，经OriginPro 7.0统计软件绘制细菌的生长曲线。

　　1.3  测试样本的制备

　　分别取牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌培养至稳定期（40 h）的菌液用低温高速离心机（4 ℃，15 000 r/min）离心10 min，取上清液1 mL加入0.5 mL磷酸盐缓冲液（2.4 g/L KH2PO4、8 g/L Na2HPO4、7.2 g/L NaCl），混匀后静置10 min。再以相同条件离心，取0.5 mL上清液加入重水0.25 mL，混匀后将样品移入核磁管中，置于-70 ℃低温冰箱保存，NMR测定前解冻并保持在0 ℃左右。

　　1.4  核磁共振图谱的采集和分析

　　采用Bruker公司TXI探头，在超导傅立叶变换NMR仪上用ZGPR脉冲序列，谱宽7 788.162 11 Hz，采样点数32 K，叠加次数128次，饱和频率和中心频率都在水峰位置。所有样本的扫描温度设置为300 K，每个样本核磁扫描均收集到131 072个数据点，以D2O为溶剂，并以溶剂峰为内标，获得39个样本的原始自由感应衰减信号（free induction decay，FID）。将这些FID信号导入MestReCv 4.9.9.6软件进行傅立叶转换（fourier transition，FT）后得到1H-NMR图谱，对1H-NMR图谱进行分段积分，将所得的积分数据归一化后导入到Excel文件中保存，用于主成分分析（principal components analysis，PCA）。

　　1.5  主成分法分析数据

　　将积分值进行中心化和比例换算，用SIMCA-P v11.0（Umea公司，瑞典）软件求出主成分（principal components，PC），并以主成分矢量为坐标轴作二维得分图，反映类别间的差异。

　　2  结果

　　2.1  生长曲线图图1为P.gingivalis、P.intermedia和F.nucleatum 的生长曲线图。从图中可以看出3种细菌分期生长特征显著且生长规律相似，至40 h均已处于稳定期中段。图 1  牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌生长曲线图Fig 1  The growth curves of P.gingivalis，P.intermedia and F.

　　2.2  核磁共振图谱的测定结果

　　图2~4分别为P.gingivalis、P.intermedia和F.nucleatum生长至40 h的胞外代谢产物核磁共振图谱。40 h为3种细菌的生长稳定期，代谢产物较稳定和丰富。图中可直观的看到3种细菌代谢图谱谱峰的分布与强度有显著的差异，各自有其特异性的代谢峰或峰群出现。P.gingivalis在化学位移值为2.900×10-6处出现特异性谱峰、P.intermedia在化学位移值为2.450×10-6处也出现特异峰, 而F.nucleatum在化学位移值为8.994×10-6处可见到强峰出现。

　　2.3  主成分法分析结果

　　将谱图进行分段积分，然后将积分值归一化后输出，用SIMCA-P软件进行主成分分析，求出主成分，以主成分矢量为坐标轴做图，称为得分图，如图5所示，3组数据大部分均位于95％的置信区间内，各细菌组间无明显交叉与重叠，团聚性较好。

　　3  讨论

　　 代谢组学是对某一生物或细胞所有低相对分子质量代谢产物进行定性和定量分析的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。依靠核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱等现代分析技术，广泛涉及药理学、毒理学、微生物学、植物功能基因组等研究领域。在研究微生物表型分类方面比较突出的是Bundy等[3]通过分析NMR代谢图谱成功地区分开临床病例来源以及实验室来源的不同蜡样芽孢杆菌。Bourne等[4]对葡萄球菌属及链球菌属的312个菌株进行代谢组学的分析鉴定，与传统鉴定方法的相符率达到92%。本课题在前期工作[5-6]的基础上，采用1H-NMR技术结合PCA分析方法进一步研究口腔牙周可疑致病菌的代谢特征。

　　细菌的代谢产物在生长稳定期大量生成，细菌数相对稳定，处于动态平衡中。选择处于稳定期的胞外代谢产物进行分析，是为了尽可能多的保留代谢信息，并增加实验结果的稳定性；严格控制细菌的培养条件、样品的制备标准以及数据的采集过程，实现实验数据的可重复性。NMR检测的样品只需要简单的预处理，离心沉淀去掉细菌和大分子物质，加入磷酸盐缓冲溶液让样品的pH值处在一个很小的波动范围内，以保证所得到的图谱中相同化合物的谱峰在相同的位置。通常测试一个样品只需要5 min，NMR基本可以满足对样品全面、快速的测定。将采集到的牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌的1H-NMR代谢图谱进行分段积分, 最终得到的主成分得分图显示，3组数据大部分均位于95％的置信区间内，各细菌组间无明显交叉与重叠，各自有较好的类聚关系，达到了预期的实验目的。这一研究结果表明，用代谢组学的方法可识别牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌的胞外代谢产物的差异，其有望成为一种新的细菌分类鉴定方法。

　　这一结果只是本课题组对代谢组学细菌分类鉴定方法的一个初步探讨。找到引起主要差异的微生物代谢的特异性生物标记物，建立微生物代谢组的标准物质数据库，结合专家检测系统，最终才能系统并快速准确的鉴定口腔细菌。从功能基因组学的角度出发，代谢产物是基因表达的终产物，基因表达水平的极微小变化也可导致代谢物的大幅改变。而从遗传基因到蛋白再到代谢表型的生物信息流中，代谢物与蛋白质、代谢物与基因之间并非直接的线性关系[7]。要获得对生物网络复杂性的准确理解，需要对体现基因活动的各类表达产物进行综合分析和总体研究，对各层次生物组数据资料进行信息整合和系统性认识[8]。随着现代科学技术的突飞猛进，对海量数据分析能力的不断提高，代谢组学将联合基因、蛋白及转录组学将微生物的分子机制阐释全面，在临床与实践指导中发挥更大的效用。

【参考文献】[1] Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E. Metabonomics： Understand-ing the metabolic responses of living systems to pathophysiologi- cal stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotic, 1999, 29（11）：1181-1189.

[2] Dettmer K, Aronov PA, Hammock BD. Mass spectrometry-based metabolomics[J]. Mass Spectrom Rev, 2007, 26（1）：51-78.

[3] Bundy JG, Willey TL, Castell RS, et al. Discrimination of pa- thogenic clinical isolates and laboratory strains of Bacillus cereus by NMR-based metabolomics profiling[J]. FEMS Microbiol Lett, 2005, 242（1）：127-136.

[4] Bourne R, Himmelreich U, Sharma A, et al. Identification of Enterococcus, Streptococcus, and Staphylococcus by multivariate analysis of proton magnetic resonance spectroscopic data from plate cultures[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39（8）：2916-2923.

[5] 李淼, 肖丽英, 李继遥, 等. 常见致龋菌代谢组学鉴定的初步研 究[J]. 华西口腔医学杂志, 2007, 25（4）：342-344. LI Miao, XIAO Li-ying, LI Ji-yao, et al. Initial study on dis- crimination of microorganisms with the metabonomics technique [J]. West China J Stomatol, 2007, 25（4）：342-344.

[6] 熊萍, 肖丽英, 李继遥, 等. 变异链球菌、 血链球菌及嗜酸乳杆 菌代谢组学鉴定的初步研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2008, 26 （5）：537-540. XIONG Ping, XIAO Li-ying, LI Ji-yao, et al. Initial study on the discrimination of oral microorganisms with a metabonomics method[J]. West China J Stomatol, 2008, 26（5）：537-540.

[7] Nobeli I, Thornton JM. A bioinformatician′ view of the metabo- lome[J]. Bioessays, 2006, 28（5）：534-545.

[8] Craig A, Sidaway J, Holmes E, et al. Systems toxicology： Inte- grated genomic, proteomic and metabonomic analysis of metha- pyrilene induced hepatotoxicity in the rat[J]. J Proteome Res, 2006, 5（7）：1586-1601.