牙周韧带细胞与骨髓基质细胞表面抗原表达的比较

　　作者：刘琼 谢昊　李五一

　　【关键词】  人牙周韧带细胞

　　［摘要］  目的：比较骨髓基质细胞与正常人牙周韧带细胞表面抗原的表达情况，探讨牙周韧带细胞与骨髓基质细胞的关系。方法：体外培养人牙周韧带细胞及骨髓基质细胞，采用免疫组化SP法检测细胞中CD14、CD44、CD105、CD34的表达，并进行图像分析。结果：与骨髓基质细胞相似，人的牙周韧带细胞上表达CD44、CD105，不表达CD34、CD14。结论：人的牙周韧带细胞与骨髓基质细胞在表面抗原特性上有相似性。　　　　［关键词］  人牙周韧带细胞  骨髓基质细胞  CD14 CD34 CD44 CD105

　　Comparison of Surface Antigen Expression between Human Bone Marrow Cells and Periodontal Ligament Cells.

　　LIU Qiong, XIE Hao, LI Wu-yi.

　　School of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430079　　　［Abstract］Objective: To compare the expression of surface antigen between bone marrow cells and human periodontal ligament cells. To investigate the relationship between human periodontal ligament cells and bone marrow cells. Methods: Primary cell culture was used to obtain periodontal ligament cells and bone marrow cells. The expression of CD14、CD34、CD44、CD105 on these cells were detected by immunohistochemistry. The images of immunohistochemistry were analyzed with color image analyze system and the data was analyzed with SPSS. Results: Similar to bone marrow cells, human periodontal ligament cells express CD44、C105，the expression of CD34、CD14 were negative. Conclusion: hPDLCs and hBMSCs have some similar surface antigen.

　　［Key words］  Human periodontal ligament cell  Bone marrow stromal cell  CD14  CD34  CD44 CD105

    牙周韧带细胞是牙周组织中的主要细胞，它对维持牙周组织稳态及修复再生牙周韧带有重要作用。人们一直认为牙周韧带中有前体细胞存在，这些细胞可以再生修复牙周韧带，这与近年来提出的成体干细胞的概念吻合；2004年，SEO等［1］证实了牙周韧带细胞中有成体干细胞。但与其它干细胞一样，牙周成体干细胞的来源问题一直无明确结论。早在1987年，McCulloch［2］提出牙周韧带中的前体细胞可能源自骨髓基质，这些前体细胞来自骨髓，通过血管通道进入牙周韧带，定位于牙周韧带血管周围及骨膜间隙中［3~5］。本研究通过比较骨髓基质细胞与正常人牙周韧带细胞表面抗原的表达情况，来探讨牙周韧带细胞与骨髓基质细胞的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  高糖DMEM培养基（GIBCO, USA）,胎牛血清（GIBCO, USA）,青、链霉素（武汉华北制药厂）；小鼠抗人CD14、CD34、CD44、CD105单克隆抗体，SP-9000免疫组化染色试剂盒，浓缩型DAB试剂盒（北京中山试剂公司）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养  牙周韧带来源于因正畸或阻生拔除的健康牙，无菌条件下，刮取牙周韧带，常规组织块法进行原代培养。培养液为20％胎牛血清，100 μg/mL青、链霉素的高糖DMEM培养基，细胞游出前，每5 d换一次液，细胞游出后每3 d换一次液。当细胞生长至90％汇合时，0.25％胰酶消化传代。取3代用于实验。骨髓取自健康成人，注射器肝素化后，抽取骨髓置入预先装有DMEM培养基的无菌离心管中，100目钢网过滤，离心去上层脂肪，采用全骨髓培养法，以1×106个/cm2的密度置于25 mL培养瓶中，培养液为20％胎牛血清，100 μg/mL青、链霉素的高糖DMEM培养基，7 d后首次换液，去除未贴壁的细胞，以后每3 d换一次液。当细胞生长至90%汇合时，0.25%胰酶消化传代，取第3代用于实验。

　　1.2.2  细胞爬片  将牙周韧带细胞消化后，以1×105 个/mL的密度传代至有1 mm×2 mm小盖玻片的培养瓶中，常规培养5 d后，取出小玻片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，细胞面向上粘于载玻片上，自然晾干后，-20 ℃保存备用。

　　1.2.3  牙周韧带细胞的鉴定  采用免疫组化法进行波形蛋白、角蛋白染色，改良Gomori钙-钴法进行碱性磷酸酶染色

　　1.2.4  细胞免疫组化  取出备用的细胞爬片，室温下在PBS中复温；3％H2O2 阻断30 min，双蒸水洗2次，PBS洗1次，每次5 min；羊血清封闭30 min，PBS洗3次，每次5 min；甩去，分别滴加一抗（CD14、CD34、CD44、CD105），PBS及小鼠血清作为阴性对照，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min；生物素化二抗 37 ℃孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；S-A/HRP 37 ℃孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。

　　1.2.5  图像分析  采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统，随机选取5个视野，进行吸光度分析，结果用SPSS11.5进行统计学分析，用单因素方差分析组间差别,SNK法进行多重比较，P＜0.05有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  牙周韧带细胞的鉴定  波形蛋白为阳性，证实培养的细胞为中胚层来源的间充质细胞；碱性磷酸酶染色为阳性，与牙周韧带细胞的成骨特性相符，见

　　图1  略

　　2.2  免疫组化结果  牙周韧带细胞和骨髓基质细胞相似，均一的表达CD44、CD105，不表达CD34、CD14，见图2；统计结果表明：CD105和CD44的阳性表达有差异，但是牙周韧带细胞的这两个指标的表达分别与骨髓基质细胞相应指标的表达无差异，见表1。

　　表1  牙周韧带细胞与骨髓基质细胞CD44、CD105阳性表达的比较　略

　　图2  略

　　3  讨论

    在对牙周组织的研究中，人们对牙周韧带中的前体细胞的来源大致有两种观点：1）来自晚期的牙周间充质［6］，也就是胚胎期余存在成体组织中的原始干细胞；2）存在于血管周围和邻近骨内膜间隙，因此，有可能是骨髓中的细胞通过血道进入牙周韧带中［2，7］。

    随着对骨髓细胞研究的深入，人们发现骨髓细胞中存在亚全能干细胞，可通过循环进入外周组织，分化为组织特异性干细胞［8］；并认为成体干细胞均来源于骨髓原始干细胞的不断补充［9］。这一观点在众多的组织中已得以证实，从胚胎或成年的胰腺、肝脏、骨髓、皮肤、骨骼肌、肺、肾分离出来的干细胞可能来源于骨髓［9~14］。

    本研究通过比较骨髓基质细胞与正常人牙周韧带细胞表面抗原的表达情况，证实牙周韧带细胞与骨髓基质细胞在表面抗原的表达上相似。该结果可能支持牙周韧带干细胞来源于骨髓细胞的假设。

    骨髓基质细胞虽无特异性的表面标记，但是人们常用高表达CD44、CD105，不表达CD14、CD34的特性来鉴定。与骨髓基质细胞相似:人牙周韧带细胞也高表达CD44、CD105。CD44是透明质酸盐受体，在基质细胞中呈阳性；CD105是内皮细胞、合体细胞滋养层、巨噬细胞和结缔组织基质细胞的TGF-βⅢ受体。另外，人牙周韧带细胞也不表达造血干细胞的特征性标志CD34和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。

    根据以往的研究，我们可以发现骨髓基质细胞在体外生长特性、体内再植后的组织形成中与牙周韧带细胞相似。体外生长时，与骨髓基质细胞一样是成纤维样细胞，贴壁生长且可连续传代。将细胞体内再植入牙周组织中后，牙周韧带细胞可形成成纤维样、骨样和牙骨质样组织［15~17］；骨髓基质细胞也可以再生修复牙周组织的骨缺损［18］。

    本研究则进一步发现人的牙周韧带细胞与骨髓基质细胞在表面抗原特性上有相似性,由此可以提出两种假设：1)牙周韧带细胞中有细胞可能源自骨髓基质细胞,骨髓基质细胞有可能作为牙周韧带细胞的来源参与了牙周组织的修复再生。2)与骨髓基质细胞相似的细胞有可能就是牙周韧带中的成体干细胞，具备了与骨髓基质细胞这一成体干细胞相似的表面标记。但是，尚需深入的研究来证实以上的假设。

    总之，本研究首次在人类牙周韧带细胞中检测到骨髓基质细胞的一些表面抗原，为探讨牙周韧带细胞的来源提供了思路。

　　参考文献

　　［1］  Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament ［J］. Lancet, 2004, 364(9429)∶149-155

　　［2］  McCulloch CA, Nemeth E, Sowen berg B, et al. Paravascular cells in endosteal spaces of alveolar bone contribute to periodontal ligament cell populations ［J］. Anat Res, 1987, 219(3)∶233-242

　　［3］  McCulloch CA. Origins and functions of cells essential for periodontal repair: the role of fibroblasts in tissue homeostasis. Oral Dis ［J］， 1995, 1(4)∶271-278

　　［4］  Lekic P, McCulloch CA. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue ［J］. Anat Rec, 1996, 245(2)∶327-41

　　［5］  Pitaru S, Pritzki A, Bar-Kana I, et al. Bone morphogenetic protein -2 induces the expression of cementum attachment protein in human periodontal ligament clones ［J］. Connect Tissue Res, 2002, 43(2-3)∶257-64

　　［6］  Osborn JW, Price DG. An autoradiographic study of periodontal development in the mouse ［J］. J Dent Res,1988, 67∶455-461

　　［7］  Gould TRL, Melcher AH, Brunette DM. Migration and division of progenitor cell populations in periodontal ligament after wounding ［J］. J Periodont Res, 1980, 15∶20-42

　　［8］  Hall F, Han B, Kundu R, et al. Phenotypic differentiation of tgf-betal-responsive pluripotent premesenchymal prehematopoietic progenitor (P4 stem) cells from murine bone marrow ［J］. J Hematother Stem Cell Res, 2001, 10∶261-271

　　［9］  Orlic D, Hill JM, Arai AE. Stem cells for myocardial regeneration ［J］. Cric Res, 2002, 91∶1 092-1 102

　　［10］  Jiang Y, Jahagirdar BN, Rcinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow ［J］. Nature, 2002, 418∶41-49

　　［11］  Poulsom R, Alison MR, Forbes SJ, et al. Adult stem cell plasticity ［J］. J Pathol, 2002, 197∶441-456

　　［12］  Petersen R, Bowen W, Patrene K, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells ［J］. Science, 1999, 284∶1 168-1 170

　　［13］  Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, et al. Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancrecatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes ［J］. Diabetes, 2001, 50∶521-533

　　［14］  Poulsom R, Forbes SJ, Hodivala-Dilke K, et al. Bone marrow contributes to renal parenchymal turnover and regeneration ［J］. J Pathol, 2001, 195∶229-235

　　［15］  钱奇春，陈海军，刘彦普，等.珊瑚复合人骨髓基质细胞构建组织工程骨［J］.口腔医学研究，2004，20（5）∶477-479

　　［16］  欧龙,刘宏伟,庞劲凡,等.自体牙周膜细胞移植对狗牙周组织再生的影响［J］.中华口腔医学杂志,2000,35（1）∶44-46

　　［17］  Nakahara T, Nakamura T, Kobayashi E, Kuremoto K, Matsuno T, Tabata Y, Eto K, Shimizu Y. In situ tissue engineering of periodontal tissues by seeding with periodontal ligament-derived cells ［J］. Tissue Eng, 2004, 10(3-4)∶537-544

　　［18］  刘宏伟,欧龙,庞劲凡,等.自体骨髓基质细胞用于牙周骨缺损移植的动物实验研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志, 2000, 10（3）∶117-119